陳建偉，李鵬飛，姜曉龍，趙妙妙，姚曉磊，黃洋，孟金柱，劉巖，呂麗華

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

蛋雞卵巢CHST11基因CDS序列分析

陳建偉1，李鵬飛2，姜曉龍1，趙妙妙1，姚曉磊1，黃洋1，孟金柱1，劉巖1，呂麗華1

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

根據(jù)NCBI上已公布其他物種CHST11基因的mRNA序列設(shè)計(jì)蛋雞特異性引物，應(yīng)用RT-PCR方法從其卵巢卵泡中擴(kuò)增出CHST11的CDS全序列。結(jié)果表明：CHST11基因編碼產(chǎn)物為不穩(wěn)定的疏水蛋白，經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，和其他物種的CHST11序列相比，同源性高。生物信息學(xué)軟件分析表明，CHST11蛋白不具有信號(hào)肽，在10～40位氨基酸處存在1個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)，其序列預(yù)測(cè)顯示存在13個(gè)O糖基化位點(diǎn)。CHST11基因可能參與卵巢腫瘤和卵巢癌的調(diào)控，同時(shí)也可能與卵泡發(fā)育有關(guān)。

蛋雞；CHST11基因；生物信息學(xué)分析

碳水化合物磺基轉(zhuǎn)移酶11(CHST11)是參與糖胺聚糖硫酸軟骨素(CSs)和硫酸皮膚素生物(DSs)合成過(guò)程中一種高爾基體酶[1,2]。而硫酸軟骨素(CSs)和硫酸皮膚素(DSs)對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、神經(jīng)細(xì)胞的分化、遷移和神經(jīng)保護(hù)方面起著重要作用[3～6]。同時(shí)CHST11參與維持細(xì)胞外基質(zhì)和參與生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[7～10]。試驗(yàn)表明，CHST11在人類疾病和惡性腫瘤方面起著重要的調(diào)控作用[11～13]，另外，在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中CHST11基因突變引起的功能喪失導(dǎo)致嚴(yán)重的骨骼畸形[14]。前期試驗(yàn)已證實(shí)CHST11在成年蛋雞卵巢等組織的高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中顯示有轉(zhuǎn)錄，說(shuō)明在卵巢組織中有表達(dá)，但其結(jié)構(gòu)和功能尚不明確，因此本研究運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)CHST11蛋白的結(jié)構(gòu)及編碼的蛋白質(zhì)基本性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能等進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，了解和分析目蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究CHST11對(duì)蛋雞卵泡發(fā)育上奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)采用太谷縣本地肉雞，屠宰后取小白卵泡放入液氮冷凍后保存于-80℃冰箱中。

1.1.2 主要試劑

RNAiso Plus，PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser，DNA Marker DL 2000購(gòu)自TAKARA大連寶生物公司；固相RNase清除劑購(gòu)自Andybio公司；2×Es Taq Master Mix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技公司。瓊脂糖、三氯甲烷、、無(wú)水乙醇、DEPC、異丙醇等試劑購(gòu)自北京天根。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI網(wǎng)站的Gene Bank公布的各物種的CHST11 CDS序列和雞CHST11 CDS預(yù)測(cè)序列(登錄號(hào)：XM_004937827)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性的引物送交北京六合華大基因公司合成。引物如下：

上游： 5'-CTCCGGCTTCTCTTTCGGC-3'；下游：5'-CAACCCGTCCCTCATTCCAA-3'。

1.2 RT-PCR

首先提取卵泡的總RNA,具體操作步驟參照RNAiso Plus試劑盒提取說(shuō)明書(shū)，利用核酸蛋白濃度測(cè)定儀檢測(cè)總RNA的濃度。然后用RNA PCR Kit Ver.3.0反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成，依據(jù)RT-PCR試劑盒說(shuō)明，建立20 L反應(yīng)體系：Total RNA 2 L，5×PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser 4 L，RNase free水加至20 L體系。充分混勻后置于PCR儀中37℃ 15 min，85℃ 5 s，然后取出放入4℃冰箱中備用。

1.3 全CDS序列的擴(kuò)增

根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)建立20 L反應(yīng)擴(kuò)增體系：2×Es Taq Master Mix 10 L，上下游引物各加入0.8 L，cDNA 300 ng，ddH2O加至20 L體系并充分混勻。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，割膠回收后送北京六合華大基因公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR結(jié)果

CHST11 cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示目的片段為1143 bp左右，與預(yù)期的結(jié)果相符。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 CHST11序列種屬間相似性分析

應(yīng)用NCBI上BLAST分析蛋雞CHST11 基因CDS序列與原雞、綠頭鴨、獵隼、白喉雀、預(yù)測(cè)序列的同源性，結(jié)果表明：序列同源性分別為99%，96%，94 %，95%。同時(shí)利用DNAMAN軟件進(jìn)行的蛋雞CHST11氨基酸序列與其他物種間同源序列的比對(duì)(圖2) 。

表1 蛋雞CHST11基因核酸序列與其它動(dòng)物間同源序列的相似性比較

2.3 CHST11蛋白的生物學(xué)分析

2.3.1CHST11蛋白基本性質(zhì)分析

根據(jù)在線網(wǎng)站軟件ProtParam程序?qū)HST11蛋白質(zhì)進(jìn)行基本性質(zhì)的預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果目的基因的分子量為41.1333 KD，PI值為9.08，脂肪系數(shù)為78.01，親水性指數(shù)總平均為-0.499，說(shuō)明該蛋白是疏水蛋白。由圖3可見(jiàn)，合成目的蛋白的氨基酸共有19種，其中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)共有38個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)共有48個(gè)；CHST11蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為41.13，大于40，為不穩(wěn)定蛋白。

圖2 蛋雞與原雞、綠頭鴨、獵隼、白喉雀物種間CHST11氨基酸序列比對(duì)

圖3 CHST11蛋白的氨基酸組成

2.3.2CHST11蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

信號(hào)肽指新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移(定位)的N-末端的氨基酸序列，位于分泌蛋白的N端。一般由15～30個(gè)氨基酸組成。有一個(gè)帶正電信號(hào)肽的N末端，一個(gè)中間疏水序列和一個(gè)較長(zhǎng)的帶負(fù)電荷的C末端組成。應(yīng)用網(wǎng)站上的SingalP 4.1 Server-prediction在線軟件對(duì)目的蛋白進(jìn)行信號(hào)肽分析(圖4)，結(jié)果表明，CHST11蛋白不存在信號(hào)肽序列，它不屬于分泌蛋白。

2.3.3CHST11蛋白跨膜區(qū)分析

應(yīng)用網(wǎng)站上TMHMM在線工具對(duì)目的蛋白的跨膜區(qū)域進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5。由圖可知，目的蛋白存在1個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)。

圖4 CHST11蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖

圖5 CHST11蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)示意圖

2.3.4CHST11蛋白亞細(xì)胞定位

利用在線軟件Psort Ⅱ分析CHST11基因編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，結(jié)果如圖6。該蛋白有34.8%的可能位于線粒體，有26.1%的可能位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有17.4%的可能位于高爾基體，因此推斷CHST11編碼的產(chǎn)物主要在線粒體上發(fā)揮作用。

圖6 CHST11蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

2.3.5CHST11蛋白O糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

糖基化是在酶的控制下，蛋白質(zhì)或脂質(zhì)附加上糖類的過(guò)程，使原蛋白質(zhì)正常折疊，從而發(fā)揮生理作用。通過(guò)在線軟件分析，在如圖7，該蛋白有13個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。

3 討論

本研究通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出CHST11基因全序列，并對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)、基本性質(zhì)和細(xì)胞定位等生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示蛋雞CHST11蛋白內(nèi)含有347個(gè)氨基酸，其編碼的蛋白是一個(gè)疏水性不穩(wěn)定蛋白。CHST11編碼氨基酸序列與原雞、綠頭鴨、獵隼、白喉雀預(yù)測(cè)序列同源性分別為99%，89%，88 %，98%，因此該基因保守性較強(qiáng)。生物信息學(xué)分析表明，蛋雞CHST11蛋白不具備信號(hào)肽，在10～40位氨基酸處存在1個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)，是跨膜蛋白。細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示CHST11編碼的產(chǎn)物主要在線粒體上發(fā)揮作用。

蛋白O-糖基化是指在蛋白質(zhì)的Ser/Thr上通過(guò)“多肽：N-乙酰氨半乳糖轉(zhuǎn)移酶”的催化作用，加N-acetylgalactosamine (GalNAc) 起始的黏多糖類O-糖基化，O糖基化變化也是細(xì)胞惡變和腫瘤發(fā)展的普遍特征，已有研究證實(shí)CHST11在人類疾病和惡性腫瘤方面起著重要的調(diào)控作用[11～13]。CHST11蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白有13個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。因此，我們可以通過(guò)對(duì)CHST11糖基化位點(diǎn)進(jìn)行修飾，從而可能對(duì)卵巢出現(xiàn)的卵巢癌和卵泡腫瘤的發(fā)生進(jìn)行調(diào)控。

試驗(yàn)結(jié)果表明CHST11基因在蛋雞卵巢卵泡上有表達(dá)且表達(dá)量相對(duì)較高，說(shuō)明CHST11在雌性動(dòng)物生殖生理過(guò)程有著不可或缺的作用。因此，該基因除了可能參與蛋雞卵巢腫瘤和卵巢癌病理方面有關(guān)，也可能參與卵巢生理方面的調(diào)節(jié)。對(duì)CHST11基因的探索，將有利于進(jìn)一步研究對(duì)CHST11 基因及其編碼蛋白功能的和表達(dá)特性，同時(shí)也為下一步研究CHST11基因?qū)Φ半u卵泡發(fā)育生理和病理的影響奠定基礎(chǔ)。

圖7 CHST11蛋白O糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

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AnalysisoftheCompleteCDSSequenceofCHST11inHenOvaries

Chen Jianwei1, Li Pengfei2, Jiang Xiaolong1,Zhao Miaomiao1, Yao Xiaolei1, Huang Yang1,Meng Jinzhu1, Liu Yan1, Lv Lihua1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China;2.CollegeofLifeScience,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

This study aimed to make bioinformatic analysis of the complete CDS sequence of hen ovarianCHST11 gene, specific primers were designed according to theCHST11 mRNA sequence of other species in NCBI. The results showed that the product encoded byCHST11 gene was unstable hydrophobic protein and might have important impact on follicular development, and ovarian cancer. In addition, there was highly homology with thoseCHST11 sequences of other species. One transmembrane domain was predicted among 10～40 amino acids and there were 13 O-glycosylation sites in the sequence, but the signal peptide was not found.

Hen；CHST11；Sequence analysis

2014-03-15

2014-05-10

陳建偉(1987-)，男(漢)，山西運(yùn)城人，在讀碩士，研究方向：動(dòng)物繁殖。

呂麗華，教授，博士生導(dǎo)師。 Tel：0354-6289295；E-mail：sxaullh@aliyun.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(31172211)；山西省引進(jìn)人才基金項(xiàng)目(2008080)；山西省國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2010081002)；國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(SNKF-2012-02);農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目(2010-Z43)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)橫向協(xié)作與委托項(xiàng)目(2010HX54)；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20130311027-2)

S831.2

A

1671-8151(2014)05-0418-05

(編輯：馬榮博)