李煒 賃可 周艷榮 陳柏成 陳林 安琪

基礎(chǔ)研究

制備犬胸主動(dòng)脈脫細(xì)胞血管支架的新方法

李煒 賃可 周艷榮 陳柏成 陳林 安琪

作者單位：400037 重慶市，第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院心血管外科（李煒、陳柏成、陳林）；
四川大學(xué)附屬華西醫(yī)院心血管外科（賃可、安琪）；
第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院兒科（周艷榮）

目的 研究制備犬胸主動(dòng)脈脫細(xì)胞血管支架的新方法，制備出理想的犬胸主動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)，從而為構(gòu)建組織工程血管提供支架材料。方法 在無菌條件下從成年比格犬體內(nèi)取出胸主動(dòng)脈血管段（28根），隨機(jī)分成4組：A組血管段設(shè)為正常對(duì)照組；B組血管段置于-70℃的冰箱和4℃冰箱內(nèi)反復(fù)凍融2次；C組血管段在0.1%的SDS溶液中持續(xù)震蕩1 d；D組血管段經(jīng)歷反復(fù)凍融后置于1%Triton X-100的PBS溶液和1 μmol/L PMSF的混合液中常溫下震蕩2 d，于0.01%的SDS溶液中持續(xù)震蕩1 d，最后加入核酸酶Dnase 0.2 mg/L和Rnase 0.02 mg/L消化24 h。四組血管段經(jīng)歷不同的過程后，全部從大體形態(tài)、光鏡、電子顯微鏡觀察、力學(xué)性能測(cè)試、免疫組化等角度進(jìn)行檢測(cè)并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 0.1%SDS法雖能完全脫除細(xì)胞，但制備的脫細(xì)胞基質(zhì)彈力纖維排列紊亂，部分發(fā)生斷裂，且不能保持良好的形狀和張力強(qiáng)度，管腔有不同程度的塌陷；反復(fù)凍融+1%Triton X-100+PMSF+0.01%SDS法不僅能完全脫除細(xì)胞，保持基質(zhì)纖維的正常排列結(jié)構(gòu)，而且制備的脫細(xì)胞基質(zhì)能保持良好的形狀和力學(xué)性能，管腔無塌陷。結(jié)論 聯(lián)合應(yīng)用反復(fù)凍融、Triton X-100、PMSF和SDS的方法能夠?qū)⑷刂鲃?dòng)脈的細(xì)胞成分除去，是一種制備脫細(xì)胞血管支架的有效方法。

組織工程； 脫細(xì)胞支架； 犬； 胸主動(dòng)脈

心血管疾病是一類常見的疾病，它的發(fā)病率已經(jīng)出現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。其中復(fù)雜先天性心臟病一直以來都是心臟外科治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)，其發(fā)病率相對(duì)固定，病死率較高。先天性心臟病外科中的許多手術(shù)諸如ROSS手術(shù)、Restelli手術(shù)、B-T分流手術(shù)、永存動(dòng)脈干矯治術(shù)等都需用各種帶瓣或不帶瓣的血管作為移植材料。為滿足心臟外科疾病尤其是冠心病和先心病修補(bǔ)材料的需要，血管移植物的來源就成為人們關(guān)注的問題。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的可以充當(dāng)血管修復(fù)材料的有高分子人工管道、深低溫保存的同種帶瓣大動(dòng)脈、異種血管等。但均因組織相容性較差、易造成管腔阻塞、物理性能差、遠(yuǎn)期效果不理想、超急排異反應(yīng)等缺點(diǎn)無法廣泛使用。組織工程血管的研究為解決先天性心臟病或冠心病外科血管移植材料的來源開辟了一條新的思路。采用異種血管，經(jīng)物理或化學(xué)方法去除其血管壁內(nèi)的細(xì)胞成分，獲得的脫細(xì)胞組織基質(zhì)不再具有抗原性物質(zhì)，但仍保存了血管原有的基本形態(tài)和結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，將體外培養(yǎng)和擴(kuò)增受體的血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞先后種植于脫細(xì)胞組織基質(zhì)，可望制備成功能用于臨床完整的組織工程血管，其效果遠(yuǎn)優(yōu)于其他血管材料的效果，理論上類似于自身組織的移植。

本實(shí)驗(yàn)的目的是在驗(yàn)證0.1%SDS法制備犬胸主動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)可行性的同時(shí)，進(jìn)一步探索出制備犬胸主動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)的新方法，制備比較理想的犬胸主動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)，為構(gòu)建組織工程化血管提供支架材料，也為以后構(gòu)造出完整的組織工程血管打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 Triton X-100分析純（美國Sigma公司），蛋白酶抑制劑PMSF（廣州威佳有限公司），胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）分析純（Gibico公司），0.5%新潔而滅（成都生化試劑廠），PBS（自配），DNA核酸酶（成都奧克生物試劑公司），RNA核酸酶（成都奧克生物試劑公司），十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）分析純（上海潤捷化工有限公司）。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 血管采取 成年比格犬28只，體重10～15 kg，雌雄均可。將其固定于手術(shù)床上，進(jìn)行氣管插管、全身麻醉。胸骨旁切口入路，切斷肋軟骨，撐開器撐開顯露胸主動(dòng)脈，急性處死后，在無菌條件下取其胸主動(dòng)脈，立即置入含肝素的生理鹽水中，沖洗排盡內(nèi)腔積血，輕柔剝離其外層的疏松結(jié)締組織，將獲取的胸主動(dòng)脈（犬處死后10 min內(nèi)取出）迅速放入無菌EP管中備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)血管分組 將獲得的血管段（28根）隨機(jī)分為以下4組：A組（7根）正常對(duì)照組；B組（7根）反復(fù)凍融處理組；C組（7根）單純使用0.1%SDS組；D組（7根）反復(fù)凍融+Triton X-100+PMSF+0.01%SDS組。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)過程 A組（7根）：正常血管段不加任何處理，置于4℃冰箱中。B組（7根）：將血管段放入1.5 ml凍存管，并向管中加入含10%二甲亞砜（DMSO）的M199培養(yǎng)液，把凍存管以封口膠密封，立即放入-70℃的冰箱中24 h，再放入4℃冰箱中24 h，如此反復(fù)凍融2次共4 d，最后將血管段置于4℃冰箱中。C組（7根）：用無菌生理鹽水灌沖血管內(nèi)腔數(shù)次，以去掉殘留在血管壁上的殘血，將血管段用0.5%新潔而滅PBS溶液浸泡30 min消毒滅菌后用無菌PBS溶液充分震蕩沖洗3次，每次30 min，隨后加入0.1%的SDS溶液中持續(xù)震蕩1 d，無菌PBS震蕩沖洗3次，每次30 min，得到的血管段置于4℃冰箱中。D組（7根）：將血管段放入1.5 ml凍存管中，并向管中加入含10%二甲亞砜（DMSO）的M199培養(yǎng)液，把凍存管以封口膠密封，立即放入-70℃的冰箱中24 h，再放入4℃冰箱中24 h，如此反復(fù)凍融2次共4 d。血管段自冰箱中取出后用無菌生理鹽水灌沖血管內(nèi)腔數(shù)次，以此去掉殘留在血管壁上的內(nèi)皮細(xì)胞及殘血，用0.5%新潔而滅PBS溶液浸泡30 min，后用無菌PBS溶液充分震蕩沖洗3次，每次30 min。然后加入1%Triton X-100的PBS溶液和1 μmol/L的PMSF的混合液中常溫下震蕩 2 d，該混合液中含有青霉素鈉（100 μg/ml）、鏈霉素（100 U/ml）、制菌霉素（100 U/ml），再以無菌PBS震蕩沖洗3次，每次30 min。加入0.01%的SDS溶液中持續(xù)震蕩1 d，無菌PBS震蕩沖洗3次，每次30 min。最后加入核酸酶Dnase 0.2 mg/L和Rnase 0.02 mg/L消化24 h，無菌PBS震蕩沖洗3次，每次30 min。得到的血管段放入70%的乙醇中于4℃冰箱中保存。

1.3 檢查指標(biāo)

1.3.1 大體觀察 觀察血管段經(jīng)歷不同處理過程后的外觀情況，包括顏色、彈性、韌性、管腔有無塌陷、內(nèi)膜是否光滑、表面是否變黏等。

1.3.2 蘇木精-伊紅染色 組織標(biāo)本 10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE（蘇木素-伊紅）染色，鏡下觀察細(xì)胞及血管結(jié)構(gòu)，尤其觀察脫細(xì)胞處理前后血管壁內(nèi)的細(xì)胞脫除情況，以及纖維成分的排列情況[1]。

1.3.3 彈力纖維染色 組織標(biāo)本10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，行彈力纖維染色。彈力纖維被染成棕紅色，膠原纖維被染成粉紅色，觀察血管內(nèi)彈力纖維排列情況，看彈力膜是斷裂還是保存完好。

1.3.4 掃描電子顯微鏡檢查 2.5%的戊二醛固定12 h，30%、50%、70%、90%、100%的乙醇逐級(jí)脫水，再用醋酸戊二酯固定置換；CO2臨界干燥點(diǎn)干燥，種植片表面噴金后，在SEM下觀察，重點(diǎn)看血管壁中的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的脫除情況以及彈力膜是遭到破壞還是保存完好。由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院電鏡室對(duì)脫細(xì)胞支架進(jìn)行掃描電子顯微鏡檢查。

1.3.5 力學(xué)性能測(cè)試 測(cè)試四組標(biāo)本的載荷、應(yīng)力、應(yīng)變、位移等力學(xué)指標(biāo)，并進(jìn)行比較。

1.3.6 免疫組化反應(yīng) 常規(guī)石蠟切片，脫蠟至水。室溫下以0.3%H2O2浸泡30 min，PBS洗3次，每次5 min，再以0.3%Triton X-100 37℃浸泡30 min，PBS洗3次，每次5 min。加正常羊血清，置切片于濕盒內(nèi) 37 ℃孵育 30 min，加（1∶100）鼠抗人 MHCⅠ抗體（陰性對(duì)照組不加一抗，加PBS），濕盒內(nèi)4℃孵育72 h。PBS洗3次，每次5 min，加生物素標(biāo)記的馬抗鼠抗體（1∶100），濕盒內(nèi)37℃孵育1 h。PBS洗3次，每次5 min，加ABC復(fù)合物濕盒內(nèi)37℃孵育1 h。PBS洗3次，每次5 min，DAB顯色5 min，蒸餾水終止顯色，用明礬蘇木精復(fù)染。脫水透明，中性樹膠封片。從免疫組化陽性反應(yīng)多少來評(píng)價(jià)細(xì)胞脫除情況。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 大體觀察 正常犬胸主動(dòng)脈剝?nèi)ネ饽こ浞譀_洗后，管壁呈淡紅色，彈性良好，管腔無塌陷，內(nèi)膜光滑，經(jīng)反復(fù)凍融后表面變黏，余同正常血管。經(jīng)脫細(xì)胞處理后，血管管壁呈暗黃色，管壁較脫細(xì)胞前變薄，管腔略塌陷，內(nèi)膜光滑，SDS組彈性不佳，反復(fù)凍融+Triton X-100+SDS組彈性良好（圖 1）。

2.1.2 組織學(xué)觀察

2.1.2.1 HE（蘇木素-伊紅）染色 如圖2所示，正常對(duì)照組血管和反復(fù)凍融組血管的切片中能看到深藍(lán)色的細(xì)胞核，纖維組織染成紅色，排列整齊。0.1%SDS組血管切片中已見不到深藍(lán)色的細(xì)胞核，但組織結(jié)構(gòu)顯得疏松。反復(fù)凍融+1%Triton X-100+PMSF+0.01%SDS組的切片中未見深藍(lán)色的細(xì)胞核及核物質(zhì)，纖維組織排列整齊，未見組織疏松或破壞。

2.1.2.2 彈力纖維染色 如圖3所示，可見正常對(duì)照組、反復(fù)凍融組及反復(fù)凍融+1%Triton X-100+PMSF+0.01%SDS組血管的彈力膜（棕紅色）完好，彈力纖維之間空隙較大，排列規(guī)整，未見紊亂及斷裂。0.1%SDS組血管的彈力纖維排列紊亂，部分發(fā)生斷裂。

2.1.2.3 掃描電鏡檢查 經(jīng)歷反復(fù)凍融的血管壁內(nèi)細(xì)胞發(fā)生固縮破壞，彈力膜完好。單純使用0.1%SDS組的血管細(xì)胞已經(jīng)脫除，但是彈力膜發(fā)生斷裂。反復(fù)凍融+1%Triton X-100+PMSF+0.01%SDS組的血管壁內(nèi)已經(jīng)見不到內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，彈力膜完好，且表面凹凸不平，有較多空隙（圖4）。

2.2 力學(xué)性能測(cè)試 將四組血管（各7條）用于力學(xué)性能的測(cè)試。將血管沿圓周向剪成5 mm×20 mm的長條狀，用INSTRON8874生物力學(xué)測(cè)試系統(tǒng)（Instron Co.，USA）行單軸拉伸試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)條件：常溫常壓下100N傳感器，加載速度為20 mm/min，荷載下降50%時(shí)停止加載，測(cè)定各種力學(xué)指標(biāo)，并進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果見表1及圖5。

表1 各組血管力學(xué)指標(biāo)（±s）

表1 各組血管力學(xué)指標(biāo)（±s）

注：與 A、B 組比較，aP＜0.05；與 C 組比較，bP＜0.05

組別 Max Load（N）PB（mm）A 組 4.71±0.58 0.86±0.11 9.17±4.00 88.29±19.63 -9.43±2.54 B 組 4.68±0.56 0.84±0.10 8.59±3.43 90.86±16.29 -9.55±2.74 C 組 3.61±0.70a0.69±0.07a7.72±2.58 65.89±15.02a-10.60±2.05 D 組 5.84±1.95b1.04±0.24b12.32±4.26b109.04±37.67b-7.42±5.23bTsML（Mpa）TeML（mm）TsML（%）

2.3 MHCⅠ免疫組化檢測(cè)

2.3.1 定性分析 A組和B組中的血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞高度表達(dá)MHCⅠ，陽性反應(yīng)為紅色絲狀物質(zhì)，呈細(xì)胞形態(tài)分布，見于血管壁的內(nèi)膜和中膜。C組和D組中的血管經(jīng)歷不同的脫細(xì)胞處理過程后，內(nèi)膜層已無內(nèi)皮細(xì)胞，未見免疫組化陽性反應(yīng)；中膜層亦無平滑肌細(xì)胞，僅見很少量免疫組化陽性反應(yīng)，呈小碎片散在分布，不呈細(xì)胞形態(tài)，陽性染色面積較A、B兩組明顯減少。免疫組化染色結(jié)果如圖6所示。

2.3.2 定量分析 由圖像分析可見，正常對(duì)照組及反復(fù)凍融組血管壁MHCⅠ高度表達(dá)，經(jīng)脫細(xì)胞處理后MHCⅠ明顯減少。去除小顆粒面積閾值為21，陽性顆粒面積與視場(chǎng)面積比，即MHCⅠ表達(dá)率（見表2及圖6）。

表2 各組血管MHCⅠ表達(dá)率（±s）

表2 各組血管MHCⅠ表達(dá)率（±s）

注：與A、B組比較，aP＜0.01

組別 例數(shù) MHCⅠ表達(dá)率（%）A 組 7 24.58±3.30 B 組 7 24.00±3.07 C 組 7 1.45±0.19aD 組 7 1.40±0.17a

3 討論

3.1 脫細(xì)胞血管支架的特點(diǎn) 我們選擇血管支架材料的時(shí)候要考慮到以下幾點(diǎn)：有利于細(xì)胞黏附和增殖的三維空間結(jié)構(gòu)；具備適當(dāng)?shù)牧W(xué)強(qiáng)度和良好的生物相容性；能促進(jìn)分化和新生組織的形成及與血管生成因子的相互結(jié)合調(diào)控等作用[2]。

脫細(xì)胞組織基質(zhì)（acellular tissue matrix，ACTM）是應(yīng)用物理或化學(xué)方法將異體或異種組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理，從而去除組織移植過程中引起排斥反應(yīng)的相關(guān)抗原，以用于修復(fù)損傷組織的一種十分理想的新型生物材料。它有以下特點(diǎn)：

第一，它保留了天然血管的胞外基質(zhì)成分和完整的組織結(jié)構(gòu)?；|(zhì)中的一些氨基酸殘基序列如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、精氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-纈氨酸等[3,4]，可以被細(xì)胞膜的整合素受體識(shí)別，促進(jìn)細(xì)胞在基質(zhì)上的吸附，參與細(xì)胞分裂和加快細(xì)胞分化[5]。研究表明，脫細(xì)胞基質(zhì)主要由膠原纖維、彈性纖維、糖蛋白（GAG）等組成[6]。膠原纖維和彈性纖維是維持血管彈性和機(jī)械強(qiáng)度的主要物質(zhì)，且抗原性低，生物可降解性好；GAG是一種非免疫原性的物質(zhì)，可以結(jié)合生長因子和細(xì)胞因子，對(duì)細(xì)胞的黏附、遷移、增殖和分化起調(diào)節(jié)作用[6,7]。這些成分共同形成了一個(gè)符合生理要求的微環(huán)境，促使細(xì)胞生長增殖和組織再生[8]。

第二，脫細(xì)胞支架中可溶性蛋白、脂質(zhì)、核酸等細(xì)胞成分被完全去除，因此移植體內(nèi)后引起的免疫排異和鈣化的發(fā)生率大大降低[9]。

第三，大量膠原纖維和彈性纖維的存在維持了血管的彈性和機(jī)械強(qiáng)度[10,11]，使脫細(xì)胞支架具有與天然血管相近的機(jī)械特性[12]（包括手術(shù)縫合固定易操作性），對(duì)保證血管移植物的長期通暢性起關(guān)鍵作用[13]，同時(shí)也防止了遠(yuǎn)期動(dòng)脈瘤的發(fā)生。

第四，種植種子細(xì)胞后，可有一定的恢復(fù)和生長能力。

3.2 脫細(xì)胞方法的探討 目前制備血管脫細(xì)胞基質(zhì)的方法主要有 3種：酶消化法、去污劑法和酶-去污劑法。

3.2.1 單純酶消化法 早些年人們多使用胰蛋白酶Trypsin作為主要的消化酶降解血管中的細(xì)胞成分[14]。Trypsin來源于動(dòng)物體內(nèi)，屬于生物酶類，本質(zhì)上是一種蛋白質(zhì)，被血清中的成分中和后不會(huì)產(chǎn)生任何有細(xì)胞毒性的殘留成分，所以是一種理想的脫細(xì)胞試劑。為了避免Trypsin消化后DNA成分的殘留，又有人利用RNase和DNase來消化殘留的DNA成分，使脫細(xì)胞支架材料中的殘余DNA含量少于0.1%，降低了移植后發(fā)生鈣化的可能性（組織學(xué)及掃描電鏡分析證實(shí)，經(jīng)過RNase和DNase消化后，支架材料的結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生明顯的變化）。但目前的研究表明，單純酶脫細(xì)胞法對(duì)其基質(zhì)纖維有一定程度的損傷，會(huì)使基質(zhì)管壁變薄，管腔輕微塌陷，張力強(qiáng)度降低。故單純酶脫細(xì)胞法并不是一種理想的脫細(xì)胞方法。

3.2.2 單純?nèi)ス竸┓?去垢劑使用較多的是十二烷基磺酸鈉（SDS）和聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）。Triton X-100和SDS脫細(xì)胞的原理都是破壞細(xì)胞的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞及細(xì)胞器碎裂而脫除。最近的研究表明，去垢劑對(duì)材料的力學(xué)性質(zhì)有很大的影響。離子型去垢劑SDS脫細(xì)胞效果強(qiáng)，但會(huì)使大量細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)破裂，釋放大量蛋白酶，從而損傷較多的細(xì)胞外基質(zhì)纖維，如果脫細(xì)胞支架上的膠原及彈性膜等結(jié)構(gòu)保存不完整，則將影響種子細(xì)胞的黏附、增殖、分化和生物力學(xué)特性[15]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，SDS處理后會(huì)使血管壁中的彈性膜變直，失去彈性[16]；另外SDS處理可使膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，同時(shí)材料的彈性蛋白網(wǎng)變得膨脹[17]。這種變形的彈性蛋白成分在體內(nèi)容易發(fā)生降解，降低生物材料在體內(nèi)的存在時(shí)間，導(dǎo)致血管移植物的擴(kuò)張膨脹以至于形成動(dòng)脈瘤。而非離子去垢劑Triton X-100比離子去垢劑更溫和，細(xì)胞內(nèi)蛋白酶釋放緩慢，因此對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)損傷比較小，但其脫細(xì)胞效果在不同的組織中是不同的。有研究表明，Triton X-100處理的瓣膜基本上沒有細(xì)胞成分，而動(dòng)脈等組織內(nèi)仍然有細(xì)胞殘留[18]。因此Triton X-100的脫細(xì)胞方法要根據(jù)需要配合使用SDS。

3.2.3 酶-去污劑法 由于單純的酶消化法對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分有損害，單純的去污劑法又難以全部脫除細(xì)胞，所以人們普遍將酶消化法和去污劑法結(jié)合起來制備血管脫細(xì)胞基質(zhì)。然而，根據(jù)資料，酶-去污劑法制備血管脫細(xì)胞基質(zhì)的效果還不一致，有些報(bào)道效果良好[19,20]，有些報(bào)道基質(zhì)管腔塌陷或不全塌陷[6]。鑒于此，國內(nèi)外學(xué)者開始考慮各種新型的脫細(xì)胞方法，取得了一些階段性的進(jìn)展。

3.3 本試驗(yàn)中脫細(xì)胞血管支架的制備特點(diǎn) 本次實(shí)驗(yàn)中，在使用去垢劑之前，我們?cè)黾恿朔磸?fù)凍融的過程。這樣的過程在以往的文獻(xiàn)中也有提到，但凍融的時(shí)間及條件不同，并且文獻(xiàn)中沒有對(duì)反復(fù)凍融后血管的大體及微觀改變提出充足的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，也沒有對(duì)發(fā)生改變的原因進(jìn)行分析。我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反復(fù)凍融對(duì)整個(gè)血管段的外觀及力學(xué)性能無明顯影響，光鏡下觀察血管基質(zhì)的纖維成分排列正常，彈力膜完好，但血管中的細(xì)胞成分已經(jīng)發(fā)生破壞，電鏡觀察到經(jīng)反復(fù)凍融的細(xì)胞大多發(fā)生了明顯的破裂。導(dǎo)致細(xì)胞破裂的原因我們考慮如下：細(xì)胞是由各種膜構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞表面及內(nèi)部各種細(xì)胞器表面都包被著膜樣結(jié)構(gòu)，這種膜樣結(jié)構(gòu)使得細(xì)胞與周圍環(huán)境、細(xì)胞器與細(xì)胞內(nèi)的液體環(huán)境相互獨(dú)立，彼此分開。當(dāng)細(xì)胞受到溫度的反復(fù)劇烈變化時(shí)，細(xì)胞及其內(nèi)部細(xì)胞器的體積就會(huì)隨之而變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞中的各種膜樣結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞發(fā)生溶解。然而所有的上述過程都是在低溫條件下發(fā)生的，這種低溫條件可以有效地抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的活性，從而保護(hù)基質(zhì)纖維成分，也使得血管的力學(xué)性能不會(huì)發(fā)生明顯改變。

本實(shí)驗(yàn)中我們使用十二烷基磺酸鈉（SDS）和聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）來脫除細(xì)胞。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道單獨(dú)使用這兩種洗脫劑可以脫去血管細(xì)胞（SDS的常用濃度為1%，Triton X-100的最佳濃度為1%[21]），但所需時(shí)間較長，最長 170余小時(shí)[6]，并且單獨(dú)使用時(shí)Triton X-100作用較弱，不能完全去除細(xì)胞，效率低下，而SDS又作用過強(qiáng)，雖然去細(xì)胞的效果好，但是即使利用0.1%SDS消化主動(dòng)脈血管，在血管基質(zhì)中的殘余成分仍有很大毒性，致使支架的生物相容性差，細(xì)胞無法生長[22]。目前國內(nèi)有很多人在使用SDS脫細(xì)胞，濃度大多在0.1%～1.0%范圍內(nèi)。在阜外心血管病醫(yī)院外科所做的一項(xiàng)國家863高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目中建議：用質(zhì)量濃度為0.03%SDS脫瓣膜的ECs，而脫主動(dòng)脈壁的ECs SDS濃度應(yīng)增至0.1%。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)后發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用0.1%SDS時(shí)劑量仍然偏大，血管壁內(nèi)彈力膜破壞嚴(yán)重，且細(xì)胞毒性較大，細(xì)胞無法生長。Rieder等[22]的研究也表明，使用0.1%SDS制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)由于細(xì)胞毒性過大，細(xì)胞根本無法在上面存活。Triton X-100和SDS脫細(xì)胞的原理都是破壞細(xì)胞的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞及細(xì)胞器碎裂而脫除。本實(shí)驗(yàn)將Triton X-100放在SDS之前，是因?yàn)镾DS為離子型去垢劑，脫細(xì)胞效果強(qiáng)，短時(shí)間內(nèi)大量細(xì)胞破裂后釋放的蛋白酶較多，從而引起較多的蛋白纖維損傷，影響血管的結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性，故讓柔和的非離子型去垢劑Triton X-100先去除部分細(xì)胞及內(nèi)在的蛋白酶，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶不至于短時(shí)間內(nèi)大量釋放，降低膠原纖維、彈力纖維的損傷。利用核酸酶對(duì)殘余的DNA、RNA進(jìn)行充分消化，可以進(jìn)一步降低血管支架的抗原性，也降低了疾病傳播的概率[23,24]。PMSF是一種蛋白酶抑制劑，在脫細(xì)胞溶液中加入PMSF，可以減少非特異蛋白酶的激活，對(duì)胞外基質(zhì)成分具有保護(hù)作用。從電鏡觀察結(jié)果可知，D組的血管內(nèi)膜面充滿了孔隙，這對(duì)于細(xì)胞的長入至關(guān)重要。

總之，本實(shí)驗(yàn)中采用的反復(fù)凍融+Triton X-100+PMSF+0.01%SDS的方法能夠完全脫去犬動(dòng)脈血管壁中的細(xì)胞成分，同時(shí)對(duì)血管壁的纖維成分及整個(gè)血管的力學(xué)性能沒有影響，是制備脫細(xì)胞血管支架的有效方法。

（本文圖片第383～384頁）

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New method to prepare good acellular matrices of canine thoracic aortas

LI Wei＊，LIN Ke，ZHOU Yan-rong，et al.＊Department of Cardiovascular Surgery，Xinqiao Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400037，China

Objective This paper is to explore a new method to remove all the cells from canine thoracic aortas for preparing good acellular matrices of canine thoracic aortas and then providing scaffolds for constructing tissue-engineering blood vessels.Methods Twenty eight canine thoracic aortas were divided into four groups randomized：group A（n=7）was normal canine thoracic aortas，group B（n=7）was frozen and thawed repeatedly for two times，group C（n=7）was treated with 0.1%SDS，group D（n=7）was frozen and thawed repeatedly for two times and then treated with phosphate-buffered saline（PBS）containing 1%Triton X-100 and 1 μmol/L phenyl methyl sulfonyl fluoride（PMSF）for two days，finally treated with 0.01%SDS for one day.Treated specimens were observed with naked eyes，optical microscope and scanning electron microscope，their mechanic properties were measured and compared among them.Results Although method of 0.1%SDS could entirely remove the cells of samples，the elastic fibers of vessel wall were in a great mess or destroyed，the acellular matrices prepared with it did not maintain shape and strain.The method in group D not only entirely removed the cells of samples and maintained the normal structure of matrix fiber in samples，but also maintained good shape and mechanical properties of the acellular matrices prepared.Conclusion The method in group D is a better and new method for preparing acellular matrices of canine thoracic aortas.

Tissue engineering； Acellular matrix； Dog； Thoracic aortas

AN Qi，E-mail：www.anqi_hx.163.com

安琪，E-mail：www.anqi_hx.163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.04.015

Q95-33；R654.2

A

1672-5301（2014）04-0337－06

2014-01-20）