張 翠，佟倩倩，高佳雪，尚東雨，呂海杰，蘆 瑩，康天濟(jì)

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

腎間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟病發(fā)展到終末期腎衰的共同途徑.以往的研究主要從組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子等方面對(duì)輸尿管梗阻引起腎間質(zhì)纖維化進(jìn)行闡述，而在分子水平上的研究甚少.近年來(lái)隨著人們對(duì)細(xì)胞水平應(yīng)激反應(yīng)研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)各種細(xì)胞器的應(yīng)激與多種腎臟病相關(guān).內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)啟動(dòng)的凋亡途徑是近年才發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑.它通過(guò)激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)[1]以保護(hù)由ERS所引起的細(xì)胞損傷, 恢復(fù)細(xì)胞功能, 但是如果損傷太過(guò)嚴(yán)重,內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定不能及時(shí)恢復(fù),ERS則引起細(xì)胞凋亡.CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡中具有重要作用，其表達(dá)調(diào)控可能因刺激因素、細(xì)胞種類的不同而不同,并在不同分子水平發(fā)揮機(jī)制[2].在細(xì)胞分化、凋亡及疾病發(fā)生中起廣泛作用,作為中間性作用分子,廣泛影響其下游蛋白的表達(dá)和作用, 本研究旨在從亞細(xì)胞分子水平闡明腎間質(zhì)纖維化的病理機(jī)制，探討水蘇堿對(duì)腎纖維化大鼠與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑的關(guān)系,為水蘇堿的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠60只，6～8周齡，體重(200±20) g，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格號(hào)：SCXK-(吉)-2003-2004.

1.2 主要試劑及儀器

水蘇堿(四川天然活性成分研究所，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)，依那普利(上海現(xiàn)代制藥股份有限公司).血肌酐、尿素氮試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)， 一抗兔抗鼠CHOP、caspase-3多克隆抗體、第二抗體辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京博奧森生物工程有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中山生物技術(shù)公司)，醫(yī)學(xué)病理圖象分析系統(tǒng)Image Pro Plus 6.0分析軟件(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)提供).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及大鼠UUO模型的建立

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后, 將60只大鼠按隨機(jī)表分為6組：假手術(shù)組、模型組、依那普利組、水蘇堿高、中、低劑量組，每組各10只.采用單側(cè)輸尿管梗阻法制作腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型[3-4].以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，分離左側(cè)輸尿管，在腎盂部位行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組大鼠僅分離左側(cè)輸尿管，不結(jié)扎不剪斷.術(shù)前1 d灌胃給藥，依那普利組給藥劑量為0.45 mg/(kg·d)，水蘇堿高、中、低劑量組給藥劑量依據(jù)文獻(xiàn)[5]分別為92.88、46.44、23.22 mg/( kg·d)，假手術(shù)組和模型組給同體積生理鹽水.每日給藥1次，連續(xù)14 d.術(shù)后14 d處死大鼠，取梗阻側(cè)腎臟，部分置4%多聚甲醛固定液中，余下置于液氮中速凍后-80 ℃冰箱保存.

2.2 Scr、BUN檢測(cè)

采用Glamour 2000型全自動(dòng)生化分析儀.

2.3 腎臟病理評(píng)分

常規(guī)固定、包埋、切片，行HE及Masson染色.雙盲法于光鏡400倍下分別于左上、左下、右上、右下、中間各取2個(gè)視野,每張切片共10個(gè)視野,進(jìn)行半定量分析，依據(jù)文獻(xiàn)[6]結(jié)合本模型特點(diǎn)，選取間質(zhì)纖維化、小管萎縮、間質(zhì)浸潤(rùn)、紅細(xì)胞管型、蛋白管型、間質(zhì)水腫、小管擴(kuò)張、小管細(xì)胞空泡變性8項(xiàng)指標(biāo)來(lái)判斷腎間質(zhì)病理改變,每個(gè)參數(shù)按0～3分評(píng)定(0=正常, 1=輕度受損, 2=中度受損, 3=重度受損).Masson染色觀察腎組織膠原沉積，每例切片在400倍的光鏡下，選取10個(gè)不重復(fù)的視野[7]，以藍(lán)色膠原沉積為陽(yáng)性信號(hào).采用Image Pro plus-6.0多媒體彩色病理圖像分析軟件進(jìn)行分析.計(jì)算腎間質(zhì)膠原沉積面積與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)總面積(去除腎小管管腔)的比值并取平均值.

2.4 腎組織CHOP、caspase-3表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單盲法評(píng)價(jià).借助Image Pro plus-6.0高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng),每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400) , 每個(gè)視野內(nèi)選3～5處陽(yáng)性染色區(qū)域，測(cè)定陽(yáng)性染色區(qū)域的光密度值，進(jìn)行組間比較.

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 Scr、BUN水平

模型組與假手術(shù)組比較，BUN和Scr顯著增加(P<0.01)；各治療組與模型組比較，BUN和Scr均有差異(P<0.05)，提示各治療組均能降低大鼠血清BUN、Scr水平；水蘇堿高劑量組與依那普利組比較有差異(P<0.05)，說(shuō)明水蘇堿高劑量組降低Scr、BUN作用明顯優(yōu)于依那普利組. 結(jié)果見(jiàn)圖1、2.

4.2 腎組織病理變化

圖3為HE染色圖，結(jié)果顯示，假手術(shù)組光鏡下腎小球及腎小管間質(zhì)正常；模型組腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管擴(kuò)張，上皮細(xì)胞變性、萎縮、壞死，腎間質(zhì)纖維化.模型組與假手術(shù)組比較，腎小管損傷指數(shù)有顯著性差異(P<0.01)；各治療組與模型組比較均有差異(P<0.05,P<0.01)；水蘇堿高劑量組與依那普利組比較有差異(P<0.05)，說(shuō)明水蘇堿高劑量組能明顯改善腎小管損傷程度.圖4為Masson染色，結(jié)果顯示，假手術(shù)組腎臟的膠原染色主要位于腎小球基膜、系膜區(qū)和腎小管的毛細(xì)血管周圍，腎小管周圍間質(zhì)區(qū)分部較少；模型組可見(jiàn)腎間質(zhì)大量膠原纖維增生，間質(zhì)膠原纖維呈藍(lán)色染色，灶狀分布，皮髓交接處更為明顯；模型組與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P<0.01)；各治療組與模型組比較有差異(P<0.05)；水蘇堿高劑量組與依那普利組比較有差異(P<0.05)， 比較圖見(jiàn)圖5、6.

1—假手術(shù)組；2—模型組；3—依那普利組；4—水蘇堿高劑量組；5—水蘇堿中劑量組；6—水蘇堿低劑量組與正常組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.05，cP<0.01；與依那普利組比較dP<0.05

圖4 Masson染色圖

1—假手術(shù)組；2—模型組；3—依那普利組；4—水蘇堿高劑量組；5—水蘇堿中劑量組；6—水蘇堿低劑量組與正常組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.05，cP<0.01；與依那普利組比較dP<0.05

1—假手術(shù)組；2—模型組；3—依那普利組；4—水蘇堿高劑量組；5—水蘇堿中劑量組；6—水蘇堿低劑量組與正常組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.05，cP<0.01；與依那普利組比較dP<0.05

4.3 對(duì)UUO大鼠腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異轉(zhuǎn)錄因子CHOP表達(dá)的影響

假手術(shù)組腎小管上皮細(xì)胞胞漿、腎小球臟層上皮細(xì)胞偶見(jiàn)CHOP表達(dá)；模型組腎小管上皮細(xì)胞胞漿中CHOP表達(dá)明顯增多，呈不均勻顆粒狀，腎小球表達(dá)不明顯，為棕褐色染色.模型組與假手術(shù)組比較，CHOP明顯升高(P<0.01)；各治療組與模型組比較有顯著差異(P<0.01)；水蘇堿高劑量組與依那普利組比較有差異(P<0.05)；見(jiàn)圖7、8.表明水蘇堿高劑量組能顯著降低CHOP表達(dá)，其作用優(yōu)于依那普利組.見(jiàn)圖9.

4.4 對(duì)UUO大鼠腎組織細(xì)胞凋亡因子caspase-3表達(dá)的影響

假手術(shù)組腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞胞漿有極少量caspase-3蛋白的表達(dá)；模型組及各治療組大鼠小管上皮細(xì)胞上出現(xiàn)不同程度的caspase-3陽(yáng)性表達(dá)，部分間質(zhì)細(xì)胞也有表達(dá)，表現(xiàn)為棕褐色染色.模型組與假手術(shù)組比較，caspase-3明顯升高(P<0.01)；各治療組與模型組比較有顯著差異(P<0.01)；水蘇堿高劑量組與依那普利組比較有差異(P<0.05)；表明水蘇堿高劑量組能降低caspase-3表達(dá)，作用優(yōu)于依那普利組.見(jiàn)圖10.

5 討 論

闡明腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制對(duì)于防治腎間質(zhì)纖維化和終末期腎病具有重要的臨床意義.腎小管間質(zhì)的病變及其嚴(yán)重程度決定著腎臟病的預(yù)后[8].業(yè)已證明，腎間質(zhì)纖維化程度與腎功能減退的相關(guān)性比腎小球硬化與腎功能減退的相關(guān)性更為密切[9].

本研究結(jié)果證實(shí)：術(shù)后14 d模型組左側(cè)腎臟體積較對(duì)側(cè)明顯增大,HE染色光鏡下可見(jiàn)腎間質(zhì)淋巴單核細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞變性、萎縮、壞死，腎間質(zhì)纖維化也隨UUO逐漸加重.Masson染色顯示膠原逐漸增多，皮髓交接處纖維化程度增強(qiáng).水蘇堿高劑量組與依那普利組比較有差異(P<0.05)；表明水蘇堿能能減輕腎小管損傷指數(shù)，抑制腎間質(zhì)纖維化的形成.

圖7 大鼠腎組織CHOP表達(dá)

圖8 大鼠腎組織caspase-3的表達(dá)

1—假手術(shù)組；2—模型組；3—依那普利組；4—水蘇堿高劑量組；5—水蘇堿中劑量組；6—水蘇堿低劑量組與正常組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.05，cP<0.01；與依那普利組比較dP<0.05

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，BUN、Scr排泄減少，血清中BUN、Scr濃度急劇上升，模型組與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P<0.01).各治療組中尿素、肌酐的濃度均明顯下降，水蘇堿高劑量組與依那普利組比較BUN、Scr有差異(P<0.05).提示水蘇堿能降低大鼠血清BUN、Scr水平，改善腎功能.

1—假手術(shù)組；2—模型組；3—依那普利組；4—水蘇堿高劑量組；5—水蘇堿中劑量組；6—水蘇堿低劑量組與正常組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.05，cP<0.01；與依那普利組比較dP<0.05

近年來(lái)隨著人們對(duì)細(xì)胞水平應(yīng)激反應(yīng)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)各種細(xì)胞器的應(yīng)激與多種腎臟病相關(guān).亞細(xì)胞水平的應(yīng)激包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)、線粒體應(yīng)激和核應(yīng)激.目前備受關(guān)注的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是亞細(xì)胞水平發(fā)生的早期應(yīng)激事件, 是線粒體應(yīng)激與核應(yīng)激的共同通路[10].一定程度的ERS能通過(guò)激活保護(hù)機(jī)制而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，如果該反應(yīng)能力低下則可增加細(xì)胞對(duì)刺激損傷的敏感性：同時(shí)，過(guò)強(qiáng)或過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的ERS使保護(hù)機(jī)制不能與損傷抗衡時(shí)，通過(guò)激活下游的凋亡信號(hào)分子CHOP/GADDl53、caspase等[11]可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.GADDl53/CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的轉(zhuǎn)錄因子[12-13]，屬C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員.CHOP蛋白是聯(lián)系ERS與細(xì)胞凋亡的重要中間信號(hào)分子,可通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.有研究顯示, CHOP高表達(dá)可通過(guò)抑制Bcl-2(凋亡負(fù)調(diào)節(jié)蛋白)誘導(dǎo)凋亡;還可通過(guò)與促凋亡死亡受體5(DR5)基因5翼狀區(qū)結(jié)合而增加DR5蛋白的表達(dá),DR5通過(guò)激活caspase通路誘導(dǎo)細(xì)胞的程序性死亡[14].CHOP活化是多種損傷因素作用下平滑肌細(xì)胞、胰島B細(xì)胞以及肝臟細(xì)胞凋亡最重要的信號(hào)途徑[15-16].本研究發(fā)現(xiàn)：術(shù)后14dUUO大鼠腎組織CHOP的表達(dá)量迅速增加，假手術(shù)組大鼠腎組織中幾乎無(wú)表達(dá)，水蘇堿高劑量組與依那普利組比較CHOP有差異性(P<0.05)；說(shuō)明水蘇堿能降低由于應(yīng)激造成的CHOP高表達(dá)，且作用優(yōu)于依那普利組.這與文獻(xiàn)報(bào)道在正常情況下，CHOP主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，在非應(yīng)激狀態(tài)下,它的表達(dá)水平很低,而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中，表達(dá)量大大增加, 最終通過(guò)激活caspase-3 從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]是一致的.

caspase亦稱自細(xì)胞介素lB轉(zhuǎn)化酶(ICE)或死亡蛋白酶，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最重要的蛋白酶.caspase-3是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，也是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路.其以酶原的形式合成和存儲(chǔ)，只有在細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中才轉(zhuǎn)化成活化形式.caspase-3的活化為細(xì)胞凋亡的早期生化指標(biāo)[18-19]，在凋亡病理過(guò)程中起著重要作用.本研究結(jié)果顯示術(shù)后14 dUUO大鼠腎組織caspase-3的表達(dá)量迅速增加，表明腎小管上皮細(xì)胞已出現(xiàn)凋亡.給藥后水蘇堿高劑量組與依那普利組比較caspase-3有差異性(P<0.05)；說(shuō)明水蘇堿能降低caspase-3高表達(dá)，阻止細(xì)胞凋亡且作用優(yōu)于依那普利組.研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后14dUUO大鼠腎組織CHOP、caspase-3的高表達(dá)，提示促凋亡分子CHOP介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性細(xì)胞凋亡是UUO引起腎小管上皮細(xì)胞損傷的新途徑；表明CHOP、caspase-3介導(dǎo)的ERS相關(guān)途徑參與了腎間質(zhì)纖維化過(guò)程.UUO大鼠腎組織CHOP表達(dá)量上調(diào)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡表達(dá)量增加的變化規(guī)律一致.由于凋亡是一程序性過(guò)程，因此從UUO大鼠至CHOP、caspase-3活化這段時(shí)間是腎損傷干預(yù)細(xì)胞凋亡、減輕繼發(fā)性腎間質(zhì)纖維化的最好治療時(shí)窗.

本文研究結(jié)果表明, 水蘇堿能夠降低CHOP參與誘導(dǎo)的ERS細(xì)胞凋亡反應(yīng),提示水蘇堿具有降低UUO大鼠腎組織ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡反應(yīng)的作用,其作用機(jī)制可能與其抑制CHOP蛋白表達(dá)有關(guān).

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