張秋爽，張國(guó)珍*，李大波，張國(guó)財(cái)

(1.東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱150040；2.紅花爾基林業(yè)局)

在植物生存環(huán)境受到諸如干旱、溫度、病蟲(chóng)害、土壤pH、金屬的脅迫時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，活性氧量與抗氧化系統(tǒng)間的平衡就會(huì)被打破，對(duì)植物造成損傷[1]。在環(huán)境脅迫初期，植物體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)上升，自身會(huì)產(chǎn)生一定的保護(hù)性反應(yīng)，酶促防御系統(tǒng)和非酶促防御系統(tǒng)就會(huì)發(fā)揮作用[2]。植物體內(nèi)通過(guò)SOD、CAT和POD同工酶的相互協(xié)調(diào)配合，可清除過(guò)剩的自由基，使體內(nèi)自由基維持正常的動(dòng)態(tài)平衡，提高植物抗逆性。SOD的主要功能是特異性的催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)，對(duì)防止活性氧對(duì)機(jī)體的傷害及防御機(jī)體衰老有十分重要的作用[3]。在植物中存在Cu·Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三種。測(cè)定SOD的方法有NBT光化還原法、超氧化鉀直接測(cè)定法、鄰苯三酚自氧化法和黃嘌呤氧化酶法等[4]。

本試驗(yàn)采用黃嘌呤氧化酶法，對(duì)遭受棘梢斑螟[5]危害的樟子松球果中的SOD活性進(jìn)行測(cè)定，以確定最佳測(cè)定條件。

1 試驗(yàn)材料

1.1 球果：采自內(nèi)蒙古紅花爾基林業(yè)局林場(chǎng)，按危害程度不同，分成4個(gè)等級(jí)，健康的為0級(jí)，表面有輕微取食痕跡的為1級(jí)，中度危害(表面能看到兩個(gè)取食孔)為2級(jí)，重度危害(表面有3個(gè)或3個(gè)以上取食孔，球果表面產(chǎn)生變色現(xiàn)象)為3級(jí)。

1.2 試劑：磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、冰醋酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、95%乙醇、85% H3PO4、標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白、氯化鈉、雙蒸水、碳酸鈣、石英砂、SOD測(cè)試盒(南京建成)。

1.3 儀器設(shè)備：研缽、離心機(jī)、分析天平、電熱恒溫水浴鍋、移液器、1cm光徑比色皿、紫外分光光度儀。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)流程

2.1.1 相同危害等級(jí)的球果樣品混在一起，準(zhǔn)確稱取樟子松球果2g，加入8mL 0.1mL/L pH=7.2的磷酸鹽緩沖液，加少量碳酸鈣和石英砂，冰浴下研磨成勻漿，制備成20%的勻漿液，3500～4000r/min離心10min，取上清液待測(cè)。

2.1.2 按下表加入試劑，應(yīng)用液要現(xiàn)用現(xiàn)配。

表1 SOD活性測(cè)定流程 mL

混勻，室溫放置10min后，于波長(zhǎng)550nm處，1cm光徑比色皿，用雙蒸水調(diào)零，進(jìn)行比色。

2.2 最佳取樣量確定

由于酶的百分抑制率與酶的活力呈拋物線關(guān)系，抑制率在15%～55%基本為正比關(guān)系，因此最佳取樣量應(yīng)控制在15%～55%，以45%左右為最佳。

抑制率R=(對(duì)照OD值—測(cè)定OD值)/對(duì)照OD值

2.3 顯色時(shí)間對(duì)SOD活力的影響

有時(shí)由于實(shí)驗(yàn)量等因素的影響，導(dǎo)致不能及時(shí)測(cè)定樣品的吸光度，故設(shè)計(jì)不同顯色時(shí)間。在混勻后，分別于室溫放置10、15、20min測(cè)定吸光度，用SPSS17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2.4 試驗(yàn)的可重復(fù)性

取10個(gè)健康球果樣品進(jìn)行3平行試驗(yàn)，計(jì)算變異系數(shù)。

2.5 總SOD活力計(jì)算

2.5.1 根據(jù)組織濕重進(jìn)行換算

以每克組織在1mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位(U)。

注：R為抑制率；V1為反應(yīng)液總體積(mL)；V2為取樣量(mL);勻漿液濃度(g/mL)C1=(組織濕重(g))/(勻漿介質(zhì)體積(mL))

2.5.2 根據(jù)蛋白濃度進(jìn)行換算

蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。以每毫克組織蛋白在1mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位(U)。

注：R為抑制率；V1為反應(yīng)液總體積(mL)；V2為取樣量(mL)；C2為待測(cè)樣本蛋白濃度(mgprot/mL)；mgprot為毫克蛋白數(shù)。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 最佳取樣量確定

表2 不同取樣量下SOD抑制率

因此，取樣量定為80μL。

3.2 顯色時(shí)間對(duì)SOD活力的影響

顯色10、15、20min所測(cè)OD值，進(jìn)行單因素ANOVA分析，P值為0.859>0.05，差異不顯著，因此顯色時(shí)間對(duì)SOD活力影響不大。

3.3 可重復(fù)性

測(cè)定結(jié)果，吸光度OD=0.337±0.007，P值為0.336，樣品間差異不顯著；變異系數(shù)CV為(1.19±0.11)%，可見(jiàn)該方法可重復(fù)性良好。

3.4 用不同方法計(jì)算總SOD活力

3.4.1 組織濕重法

圖1 組織濕重法SOD總活力趨勢(shì)圖

用組織濕重法表示總SOD活力，隨危害等級(jí)的增加，總SOD活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，危害等級(jí)為2級(jí)時(shí)總SOD活力最高，3級(jí)時(shí)雖有所下降但仍高于0級(jí)。顯著性檢驗(yàn)時(shí)，P值為0.000，說(shuō)明不同危害等級(jí)的球果SOD活力差異極其顯著。

3.4.2 用蛋白濃度表示總SOD活力

蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線y=.0069x，R2=0.999

表3 不同危害等級(jí)的球果中蛋白濃度

圖2 蛋白濃度法SOD總活力趨勢(shì)圖

用蛋白濃度法表示SOD總活力，結(jié)果與組織濕重法基本一致，可以排除蛋白質(zhì)的存在對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。顯著性檢驗(yàn)，P值為0.000，說(shuō)明不同危害等級(jí)的球果SOD活力差異極其顯著。

4 結(jié)論

樟子松是我國(guó)固沙造林地區(qū)重要的造林樹(shù)種之一，具有耐瘠、耐旱、防風(fēng)、固沙特點(diǎn)[6]。在遭受棘梢斑螟危害后，樟子松球果SOD活性發(fā)生顯著變化。結(jié)果表明，隨危害等級(jí)的增加，總SOD活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，危害等級(jí)為2級(jí)時(shí)總SOD活力最高，為108.51U/mg prot，危害等級(jí)為3級(jí)時(shí)總SOD活力82.36 U/mg prot，雖有所下降但仍高于0級(jí)的74.74 U/mg prot，說(shuō)明樟子松在逆境(蟲(chóng)害)條件下，發(fā)生明顯的防御反應(yīng)，來(lái)降低自身的損傷。采用黃嘌呤氧化酶法[7]測(cè)定樟子松球果總SOD活力，應(yīng)用液與顯色劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，最佳取樣量為80μl，此時(shí)SOD抑制率為46.5%，線性關(guān)系最佳，測(cè)定效果好，該方法顯色穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)，適用于樟子松球果總SOD活力測(cè)定。研究結(jié)果可為樹(shù)種抗性選優(yōu)提供理論依據(jù)，在害蟲(chóng)綜合治理中，利用植物本身的抗蟲(chóng)性是重要的策略[8]。

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