李胤靜，張娜，楊寶柱，劉雪梅，陳迪

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省食品科學(xué)與工程重點實驗室，哈爾濱150076)

大豆蛋白除了具有極高的營養(yǎng)價值外，還具有持水、乳化、吸油、凝膠、起泡、粘結(jié)等功能特性。由于其良好的功能特性、較高的營養(yǎng)價值和低廉的價格，使其被廣泛應(yīng)用于多種食品體系[1]。而大豆分離蛋白又是其中的代表性物質(zhì)，所以有很多人用不同的研究方法對大豆分離蛋白進行處理[2-5]，進而改善其功能性質(zhì)，使其更廣泛的應(yīng)用于各個領(lǐng)域[6-10]。各種改性方法中酶修飾綜合了其他反應(yīng)的優(yōu)點，被大家廣泛認(rèn)可，并進行各項研究，但現(xiàn)有的研究一般采用的是單一酶對大豆分離蛋白進行處理[11-12],可在此類研究的基礎(chǔ)上進一步利用雙酶更好的改善大豆分離蛋白的功能性。

本研究利用Alcalase堿性蛋白酶(內(nèi)切酶)對大豆分離蛋白進行限制性酶解。通過對酶解過程的優(yōu)化，利用電泳對酶解產(chǎn)品進行表征，并考察了酶解前后大豆分離蛋白的功能性，確定雙酶酶解對大豆分離蛋白功能性質(zhì)的改善程度，為大豆分離蛋白產(chǎn)品更好的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

材料：大豆分離蛋白(SPI，蛋白質(zhì)含量90.1%，干質(zhì)量)。Alcalase堿性蛋白酶(酶活2000U/g)，其他試劑為分析純，所用的水為去離子水。

主要儀器設(shè)備：全自動凱氏定氮儀(瑞士 Foss 公司)；真空冷凍干燥機(上海醫(yī)用分析儀器廠)；高速離心機(上海安亭科技儀器廠)；電子分析天平(塞多利斯科學(xué)儀器有限公司)；精密 pH 計(上海雷磁儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；恒溫干燥箱(上海東星建材實驗設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大豆分離蛋白的酶解

用去離子水配制底物濃度為10%的大豆分離蛋白分散液，以酶活2000 U/g，溫度60℃，pH為8.0，反應(yīng)時間50min為基準(zhǔn)條件，研究堿性蛋白酶各項單因素對水解度的影響，根據(jù)實驗結(jié)果選擇適當(dāng)?shù)膶嶒灄l件制備酶解產(chǎn)物，經(jīng)冷凍干燥，制備酶解產(chǎn)物的干粉。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 蛋白質(zhì)水解度的測定

大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物DH測定采用pH-stat 法[13]。

B：水解過程中消耗NaOH溶液的體積(mL)；

N：NaOH溶液的濃度(mol/L)；

α：大豆分離蛋白氨基的平均解離度；

M：底物蛋白質(zhì)含量(g)；

h：蛋白質(zhì)中總的可被水解的肽鍵數(shù)(大豆蛋白為 7.8 mmol/g)。

1.2.2.2 氨基氮含量的測定

大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物氨基氮含量的測定采用甲醛滴定法[14]。

V=樣品耗用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)；

V0=空白耗用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)；

N=氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液摩爾濃度。

1.2.2.3 大豆蛋白產(chǎn)品的溶解性評價

大豆分離蛋白的溶解性測定方法參考文獻進行[15]。

NSI (%) = 可溶性氮/總氮×100

1.2.2.4 大豆蛋白產(chǎn)品的保水性評價

大豆分離蛋白的保水性測定方法參考Surówka K(2004)[16]。

1.2.2.5 大豆蛋白產(chǎn)品的吸油性評價

大豆分離蛋白的吸油性測定方法參考Moure Andrés(2005)[17]。

1.2.2.6 大豆蛋白產(chǎn)品的乳化活性評價

大豆分離蛋白的乳化活性測定方法參考Moure Andrés，2005[17]。

EAI(m2/g)=2[T×A0×稀釋倍數(shù)/(C×Φ×L×10)]

T=2.303

A0=零時刻的吸光度值；

C=乳狀液形成前配制的蛋白質(zhì)濃度(g/L)；

Φ=乳狀液油相的體積分?jǐn)?shù)；

L=比色杯厚度(cm)。

1.2.2.7 SDS凝膠電泳

采用不連續(xù)垂直板狀凝膠電泳。具體實驗方法參考郭堯君(1999)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆分離蛋白的限制性酶解工藝參數(shù)的優(yōu)化

稱取大豆分離蛋白樣品30.00 g于錐形瓶中，加入蒸餾水270 mL，使其充分分散，配制成濃度10% (w/w)的大豆分離蛋白分散液，然后置于以酶活2000 U/g，溫度60℃，pH為8.0，反應(yīng)時間50min為基準(zhǔn)條件，控制其中三項不變，分別改變其中一項，研究Alcalase堿性蛋白酶中各項單因素對水解度的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1a反映出大豆分離蛋白的DH在20～200min內(nèi)隨反應(yīng)時間的增加而增大，但增加的趨勢減緩，所以選擇時間時，綜合時間利用率考慮可知不是時間越長越合適；在酶活500～2500 U/g內(nèi)DH隨著酶活的增加而增大，但增加趨勢較為緩慢(圖1b)，說明在此范圍內(nèi)受酶活影響相對其他因素影響較小，故綜合酶的使用率考慮不是酶活越大越合適；在pH值7.0～9.0范圍內(nèi)，DH隨著pH值的增加而先增加后降低(圖1c)，在pH值為8.0左右達到最適值，說明Alcalase蛋白酶反應(yīng)時pH值可選擇在8.0左右；溫度在50～70℃范圍內(nèi)，DH隨著溫度的增加而先增加后降低(圖1d)，在溫度為60℃左右達到最適值，說明Alcalase堿性蛋白酶反應(yīng)時溫度可選擇在60℃左右。

所以，綜合成本，時間利用率等各項因素考慮，本研究選擇酶活2000 U/g，溫度60℃，pH為8.0的條件下，酶解1h的工藝參數(shù)，在該工藝參數(shù)下酶解大豆分離蛋白得到DH為4.97%的酶解產(chǎn)物。

(a)

(b)

(c)

(d)

2.2 大豆分離蛋白的酶解電泳分析

對經(jīng)過限制性酶解的SPI產(chǎn)物與未酶解的SPI的進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖如圖2所示。

圖2 SPI與酶修飾SPI的凝膠電泳圖

大豆蛋白的主要組分是7S和11S球蛋白。7S組分主要含有3個亞基，分別是α、α’和β亞基；11S組分(A和B)是由酸性亞基和堿性亞基組成的六聚體，酸性亞基和堿性亞基間通過一個二硫鍵相連。從電泳分析結(jié)果可以看出：在Alcalase蛋白酶作用下，大豆蛋白的α亞基、α’ 亞基和β亞基均發(fā)生水解。11S不同水解片段集中31.0 kD和20.1 kD之間。

2.3 大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物功能性質(zhì)評價

(a)

(b)

(c)

(d)

由圖3(a)顯示，SPI與酶修飾SPI的等電點都在 pH 4.5 附近，酶解處理明顯提高了SPI的溶解性。未經(jīng)過酶解的SPC在等電點的NSI為2.91%，經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶限制性酶解后，在等電點的NSI為49.50%。Alcalase堿性蛋白酶的催化作用位點較多，導(dǎo)致堿性蛋白酶修飾產(chǎn)品中短分子片段多，因此溶解性很大程度的提高。

由圖3(b)顯示，經(jīng)過酶解修飾處理，明顯地降低了酶解修飾分離蛋白的保水性。大豆分離蛋白的保水率為5.07g/g，而Alcalase堿性蛋白酶酶解保水率為1.89g/g?？赡苁怯捎陔S著DH的增加而形成很多的小分子，不利于形成蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(凝膠)，導(dǎo)致保水性降低。

由圖3(c)顯示，SPI的吸油率最高，酶修飾后的SPI產(chǎn)物的吸油率都有不同程度的降低。SPI的吸油率為0.99g/g，經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶酶解后，吸油率為0.72g/g。蛋白質(zhì)的溶解性取決于蛋白質(zhì)分子的親水性/疏水性的平衡，這種平衡取決于蛋白質(zhì)分子的氨基酸組成，尤其取決于暴露于蛋白質(zhì)分子表面的氨基酸組成[19]。Alcalase堿性蛋白酶水解作用的主要位點是 Tyr、Phe、Try 等芳香族疏水性氨基酸殘基的肽鍵和Ala-，Leu，Val，所以隨著水解的進行，疏水基團和親水基團的數(shù)量發(fā)生改變，因此吸油率降低。

由圖3(d)顯示，SPI的酶解處理提高了酶解產(chǎn)品的乳化活性指數(shù)。SPI的乳化活性指數(shù)為35.97m2/g，經(jīng)過Alcalase堿性蛋白酶處理，乳化活性指數(shù)為40.55m2/g。酶解使蛋白質(zhì)分子變小、構(gòu)象發(fā)生改變，一些包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性殘基暴露，利于其向水油界面擴散降低界面張力，同時，水解后的肽分子更易定位于水油界面，排列更為有序[20]。所以，酶解產(chǎn)品的乳化活性指數(shù)較SPI有一定的提高，但是較大水解度的產(chǎn)物中低分子質(zhì)量的肽分子過多，所以會降低乳化活性指數(shù)的提高程度。

3 結(jié)論

利用Alcalase堿性蛋白酶對SPI在酶活2000U/g，溫度60℃，pH為8.0的條件下，酶解1h，可制得水解度為4.97%的酶解產(chǎn)物。電泳分析結(jié)果表明：在雙酶酶解下，α亞基、α’ 亞基和β亞基被水解，11S不同水解片段集中31.0 kD和20.1 kD之間。SPI經(jīng)過酶解修飾后，其溶解性有很大程度的提高，在等電點 pH 4.5處，溶解性從2.91%增大至49.50%；而保水性則降低，保水率從5.07g/g降低到了1.89g/g；吸油率從0.99g/g變化為0.72g/g；乳化活性指數(shù)從35.97m2/g變化為40.55 m2/g，有一定程度的提高。結(jié)果表明，經(jīng)過Alcalase堿性蛋白酶限制性酶解后，大豆分離蛋白的功能性質(zhì)均有不同程度的改善。

[1]逯昕.酶改性制備專用大豆分離蛋白的研究[D].無錫:江南大學(xué)食品學(xué)院, 2008.

[2]Zhong F, Wang Z, Xu S,et al.Food Chemistry, 2007,100:1371-1376.

[3]尚新彬,豆康寧.菠蘿蛋白酶水解大豆分離蛋白工藝優(yōu)化研究[J].農(nóng)業(yè)科技,2012,36:40-42.

[4]Wang X S, Tang C H, Li B S, et al.Food Hydrocolloids, 2008,22:560-567.

[5]王中江,江連洲,魏冬旭,等.pH值對大豆分離蛋白構(gòu)象及表面疏水性的影響[J].食品科學(xué), 2012,33(11):47-51.

[6]Sype J V D, Arudi R L.Preparation of coated powder[P].US patent, 0182855A1.2006-08-17.

[7]Wang H, Wang T, Johnson L A.Mechanism for refunctionalizing heat-denatured soy protein by alkaline hydrothermal cooking[J].Journal of the American Oil Chemists' Society, 2006, 83(1): 39-45.

[8]張春嶺,潘思軼.化學(xué)改性對大豆分離蛋白表面疏水性的影響[J].中國糧油學(xué)報, 2009,24(6):26-30.

[9]趙新淮,侯瑤.大豆蛋白限制性酶解對乳化性質(zhì)和吸油性的影響[J].農(nóng)業(yè)機械學(xué)報，2009,40(12):159-163.

[10]劉大川,張維農(nóng).中國大豆蛋白工業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[C].中國糧油學(xué)會第二屆學(xué)術(shù)年會論文選編, 2002:17-19.

[11]孫欣,王璋,王莉,等.輕度酶解對大豆蛋白膠凝性和疏水性的影響[J].食品科學(xué), 2005,26(12):37-39.

[12]侯瑤.大豆?jié)饪s蛋白和大豆分離蛋白限制性酶解及功能性變化[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[13]Adler-Nissen J.Enzymatic hydrolysis of food proteins[M].Elsevier Applied Science Publishers, London and New York, 1986: 9-24.

[14]吳建中.大豆蛋白的酶法水解及產(chǎn)物抗氧化活性的研究[D].廣州:華南理工大學(xué), 2003.

[15]劉宏芳,侯瑤,趙新淮.大豆蛋白限制性酶解修飾與產(chǎn)品的溶解性和保水性變化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2009,40(1):97.

[17]Moure Andrés, Domlínguez Herminia, Parajó Juan Carlos.Fractionation and enzymatic hydrolysis of soluble protein present in waste liquors from soy processing[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry.2005,53:7600-7608.

[18]郭堯君.蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,1999:262-263.

[19]ANDRES M, SINEIRO J, HERMINIA D, et al.Functionality of oilseed protein products: a review[J].Food Research International, 2006, 39(9): 945-963.

[20]Nakai S.Structure relationship of food proteins with and emphasis on the import -ance of protein hydrophobicity[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1983, 31 (4):676-683.