周巖方，楊明，劉麗，孫霞

（1.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江臺(tái)州318020；2.山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，山東濟(jì)南250100）

蚤休提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠腦損傷的保護(hù)作用研究

周巖方1，楊明1，劉麗1，孫霞2

（1.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江臺(tái)州318020；2.山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，山東濟(jì)南250100）

目的探討蚤休提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法100只健康SD大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，假手術(shù)組、模型組和蚤休提取物低、中、高劑量組（濃度分別為25、50、100mg／kg），每組各20只。注射Ⅶ型膠原酶建立大鼠腦出血模型，蚤休提取物組給于相應(yīng)濃度灌胃，模型組和假手術(shù)組給于生理鹽水。分別于灌胃后第3、5、7天對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，并每組取6只大鼠進(jìn)行腦組織含水量、腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）含量和血漿中TNF－α含量檢測(cè)。結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，蚤休提取物低、中、高劑量組均能顯著降低大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分（P＜0.05，P＜0.01）。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織SOD活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，蚤休提取物中、高劑量組均能顯著降低大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分（P＜0.05）。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血漿中TNF-α含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，蚤休提取物中、高劑量組均能顯著降低大鼠血漿中TNF-α含量（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論蚤休提取物能夠降低Ⅶ型膠原酶誘導(dǎo)的腦出血大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分，改善腦組織水腫癥狀，通過提高腦組織血漿SOD水平，抑制脂質(zhì)體氧化，減少TNF-α的產(chǎn)生，對(duì)腦出血大鼠受損的腦組織具有保護(hù)作用。

腦出血；蚤休；大鼠；保護(hù)作用

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）多發(fā)生在中老年人群 中，每年腦出血患者占腦卒中患者35%左右，是我國(guó)的常見多發(fā)病。ICH起病較急、死亡率高［1］。臨床顯示，相當(dāng)一部分患者因腦出血會(huì)遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙等后遺癥，使部分患者喪失勞動(dòng)力，增加家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來(lái)腦出血發(fā)病趨于年輕化［2］。臨床上對(duì)于腦出血的治療主要是涉及止血、降壓等病癥控制，并不能真正解決腦出血造成的神經(jīng)功能缺損。因此，減少腦水腫和控制炎癥反應(yīng)發(fā)生，改善微循環(huán)以保護(hù)患者腦組織、最大程度恢復(fù)腦功能是治療腦出血的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)通過誘導(dǎo)大鼠腦出血模型，采用不同劑量中藥蚤休提取物治療腦出血大鼠，探討蚤休提取物對(duì)腦出血大鼠腦損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級(jí)SD大鼠100只，體質(zhì)量220～250g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（湘）20120011，置于本院動(dòng)物病房，飼養(yǎng)條件：室溫22～25℃，保持正常的飲食飲水、活動(dòng)自由，待大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥品與試劑：Ⅶ型膠原酶（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)126k8600）；SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20110418）；TNF-α試劑盒（上海百蕊生物科技有限公司，批號(hào)20111012）；10%水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司，批號(hào)20090407）；肝素（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司，批號(hào)40118660）；蚤休提取物制備：蚤休藥材粉末（亳州安東制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)20120201）用75%～95%乙醇回流提取，重復(fù)提取2次，每次2 h，過濾，濾液加氧化鈣溶液調(diào)pH至12左右，過濾，濾液用稀鹽酸調(diào)pH值至中性，減壓回收溶劑至浸膏狀，噴霧干燥得蚤休提取物。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥：將100只SD實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、腦出血模型組、蚤休提取物低、中、高劑量組，每組各20只，蚤休提取物低、中、高劑量組分別按25、50、100mg／kg劑量灌胃給藥，溶劑為100 mL濃度為5%的葡萄糖；灌胃前需禁水3 h。每天1次，連續(xù)給藥3 d，假手術(shù)組和模型組采用同等體積的生理鹽水灌胃。

1.2.2 大鼠腦出血模型制備：大鼠用10%水合氯醛麻醉。大鼠俯臥位固定后，剃除頂毛后，75%乙醇消毒，于頭皮正中切口0.8 cm，剪開骨膜以暴露前囟，于前囟前0.2mm，中線左旁開3mm處鉆孔，用微量注射器（針頭直徑0.7mm）沿鉆孔進(jìn)針，深約5.8mm（剛好在尾狀核位置），緩慢注射2μLⅦ型膠原酶和含肝素的生理鹽水1.2μL，注射時(shí)間3min，留針8min后退針，縫合皮膚。假手術(shù)組僅注入等量生理鹽水，其余操作同給藥組和模型組。

1.2.3 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分：根據(jù)Bederson［3］評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。采用NSS評(píng)分對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分：神經(jīng)功能正常為0分；提尾時(shí)左前肢屈曲為1分；行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；行走時(shí)向左側(cè)傾斜為3分；無(wú)法自行行走，意識(shí)減退為4分。分別于術(shù)后第3、5、7天對(duì)各組大鼠行為學(xué)變化進(jìn)行觀察并評(píng)分。分值越高，神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。

1.2.4 腦含水量、腦組織超氧化物歧化酶（SOD）含量及血漿中TNF-α含量的測(cè)定：分別于第3、5、7天后將各組取6只動(dòng)物，迅速取腦，除去積血，切取前半部分腦組織做腦含水量測(cè)定。腦含水量測(cè)定采用干濕重法［4］：腦組織含水量（%）＝（濕重－干重）／濕重×100%。迅速取右側(cè)腦組織，加冷生理鹽水，用玻璃勻漿器制備10%腦勻漿，離心取上清液，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，試劑盒為廠家提供的配套產(chǎn)品。下腔靜脈取血4mL，裝入含肝素的試管中，離心，冷凍備測(cè)。運(yùn)用ELISA法檢測(cè)大鼠腦組織血漿中TNF-α水平，采用配套試劑盒，操作方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用±s”表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 模型組腦出血大鼠在試驗(yàn)周期內(nèi)其神經(jīng)病學(xué)評(píng)分均高于2分以上，神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；蚤休提取物3種劑量水平在第3、5、7天后均能顯著降低大鼠神經(jīng)功能評(píng)分（P＜0.05，P＜0.01，見表1）。

表1 表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分Tab.1 Changes of neurological function of rats in each group at different time points

2.2 大鼠腦含水量比較 模型組大鼠第3天腦組織含水量較假手術(shù)組明顯升高，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），蚤休提取物低、中、高劑量組治療的大鼠腦組織含水量與模型組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表2 表2 蚤休對(duì)ICH大鼠腦組織含水量的影響Tab.2 Paris polyphylla effect on brain tissue water content of ICH rats

2.3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織SOD的檢測(cè) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦出血之后第3、5、7天，大鼠腦組織血漿的SOD活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，蚤休提取物中、高劑量組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦組織血漿的SOD活性顯著升高（P＜0.05，見表3）。

表3 各組大鼠第3 d、5 d、7 d腦組織SOD活性比較Tab.3 Comparison of SOD activity in brain tissue section among each groups at different time points

2.4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿中TNF-α含量的檢測(cè) 與假手術(shù)組比較，腦出血模型組各時(shí)間點(diǎn)血漿中TNF-α的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；蚤提取物低、中、高劑量組各時(shí)間點(diǎn)血漿中TNF-α的含量較腦出血模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較有所降低（P＜0.05，見表4）。

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿中TNF-α含量比較Tab.4 Comparison of plasma TNF-αcontent in brain tissue section at different time points among each groups

3 討論

研究報(bào)道許多因素都可以誘發(fā)導(dǎo)致高血壓，高血壓是導(dǎo)致ICH發(fā)病的主導(dǎo)原因，近年來(lái)，我國(guó)由高血壓引發(fā)的腦出血發(fā)病率增加，且呈年輕化的趨勢(shì)。腦出血的發(fā)病多在早晨至中午時(shí)間段，可能的誘因是情緒激動(dòng)。目前對(duì)于腦出血的治療主要是控制血壓等，但無(wú)法保護(hù)受損的腦組織。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦出血屬于“中風(fēng)”范疇，年老體弱、勞累過度、飲食不節(jié)等因素導(dǎo)致氣血虧虛而猝然昏仆，半身不遂等；中醫(yī)研究者們認(rèn)為導(dǎo)致腦中風(fēng)的基本病理機(jī)制為淤血阻滯，臨床醫(yī)生應(yīng)用活血化瘀的中草藥治療出血性腦中風(fēng)是廣大醫(yī)護(hù)工作者研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)中藥有效保護(hù)缺血性腦損傷多通過保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、改善微循環(huán)、增加SOD活性；同時(shí)具有清除氧自由基、抑制炎癥發(fā)生，保護(hù)缺血腦神經(jīng)細(xì)胞的作用，一些中藥注射液可有效抑制細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞凋亡率，從而修復(fù)受損腦組織［5］。

腦水腫會(huì)導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高。腦水腫形成的腦疝往往導(dǎo)致腦出血患者病情惡化或死亡［6-7］。腦出血后腦損傷的嚴(yán)重程度可以在一定程度上通過腦組織含水量而衡量［8］。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的腦出血后大鼠腦組織含水量顯示，腦出血模型組大鼠腦含水量水平明顯高于假手術(shù)組，說(shuō)明建模成功。相對(duì)于模型組，蚤休各劑量組腦出血大鼠腦水含量都有降低，降低程度具有劑量依賴性，高劑量組大鼠腦含水量略高于假手術(shù)組。提示蚤休提取物能減輕腦水腫程度來(lái)保護(hù)受傷的腦組織。

報(bào)道指出，缺血缺氧的受損腦組織會(huì)產(chǎn)生大量自由基［9］。自由基的氧化應(yīng)激作用會(huì)導(dǎo)致腦組織細(xì)胞進(jìn)一步損傷。SOD是清除機(jī)體內(nèi)過量負(fù)離子自由基的首要物質(zhì)。通過檢測(cè)腦組織血漿中SOD水平了解機(jī)體對(duì)自由基的清除能力。相關(guān)研究顯示，大鼠腦出血后腦組織中SOD水平下降［10-12］。本實(shí)驗(yàn)顯示，模型組大鼠SOD活性與假手術(shù)組比較，在各時(shí)間點(diǎn)都顯著降低（P＜0.01）?？赡苁怯捎诋a(chǎn)生大量氧自由基，消耗了腦組織血漿內(nèi)的SOD。采用不同劑量蚤休提取物治療后，發(fā)現(xiàn)中、高劑量組提取物較模型組SOD含量有所提高（P＜0.01），表明蚤休提取物可提高體內(nèi)SOD水平，增強(qiáng)機(jī)體抗氧負(fù)自由基能力。

腦出血損傷后可導(dǎo)致炎癥發(fā)生，研究認(rèn)為，許多炎癥細(xì)胞因子（如TNF-α、IL系列）是介導(dǎo)腦水腫發(fā)生的相關(guān)因子，TNF-α與炎癥發(fā)生密切相關(guān)［13-14］。發(fā)生腦缺血時(shí)TNF-α在病灶周圍及血漿中濃度增高［15］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠腦組織血漿中TNF-α的濃度較低；與腦出血模型組相同時(shí)間點(diǎn)血漿中的濃度比較，中、高劑量蚤休提取物治療組在各時(shí)間點(diǎn)血漿中TNF-α的濃度均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），低劑量組與模型組比較TNF-α的濃度也有所降低（P＜0.05），這說(shuō)明蚤休提取物對(duì)大鼠腦出血后血腫周圍炎癥反應(yīng)有一定的療效。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功建立腦出血模型組大鼠，蚤休提取物能夠降低腦出血大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，一定程度上改善腦部水腫癥狀，通過提高腦組織血漿SOD水平，抑制脂質(zhì)體氧化，減少炎癥發(fā)生，能夠保護(hù)腦出血大鼠受損的腦組織。

［1］ 任澤光，吳建中.大鼠腦出血模型［J］.中華神經(jīng)外科雜志，1993，9（4）：205.

［2］ 趙明哲，丁秋蕾，劉瑛，等.血清白細(xì)胞介素6與急性幕上自發(fā)性腦出血的相關(guān)性研究［J］.臨床薈萃2007，13（2）：19-22.

［3］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472.

［4］ 汪遠(yuǎn)金，方正清，王欣茂，等.川芎嗪對(duì)胰島素抵抗大鼠急性局灶性腦缺血tPA，PAI，DD和ET-I含量的影響［J］.中國(guó)中藥雜志，2003，28（19）：1182.

［5］Fitzpatrick DF，Bing B，Maggi DA，et al.Vasodilating procyanidins derived from grape seeds［J］.Ann N Y Acad Sci，2002，95（7）：78-89.

［6］ 李桂生，田京偉，傅風(fēng)華，等.人參皂苷Rb3對(duì)腦缺血大鼠腦線粒體損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)新藥雜志，2006，15（7）：518.

［7］ 鄧平，吳曉牧.高血壓腦出血病理生理機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中華腦血管病雜志，2010，4（4）：267-278.

［8］Rodrigues CM，Sola S，Nan Z，et al.Bile acids in treatment of ocular disease［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（10）：6087-6092.

［9］Suen DF，Norris KL，YoμLe RJ，et al.Mitoehondrial dynamics And apoptosis［J］.Genes Dev，2008，22（2）：77-90.

［10］ 張凱波，吳松泉.兩種刺五加提取物對(duì)大鼠腦缺血／再灌注損傷后SOD和MDA水平的影響［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2010，29（9）：44-45.

［11］李明花.活血開竅湯對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠SOD、MDA的影響［D］.天津醫(yī)科學(xué)，2013.

［12］ 張凱波，吳松泉.兩種刺五加提取物對(duì)大鼠腦缺血／再灌注損傷后SOD和MDA水平的影響［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2010，29（11）：44-45.

［13］ 盛懷龍，董秀蘭，李寶福.毛冬青提取物對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后TNF-α及Caspase-3表達(dá)的影響［J］.遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，2（10）：141-143，200.

［14］ 盛懷龍，董秀蘭，姜永飛.毛冬青提取物對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)新藥雜志，2009，18（11）：1020-1022.

［15］ 沈立，郭芳，王永利，沈伏，高松.銀杏葉提取物對(duì)缺血再灌注大鼠腦內(nèi)SOD，GSH-Px和MDA的影響［J］.中國(guó)新藥與臨床雜志，2004，10（12）：691-694.

（編校：王儼儼）

Study on protective effect of Paris polyphylla on intracerebral hemorrhagic brain injury rats

ZHOU Yan-fang1，YANGMing1，LIU Li1，SUN Xia2

（1.Department of Neurosurgery，Taizhou First People's Hospital，Taizhou 318020，China；2.Department of Basic Medical，Shandong University，Jinan 250100，China）

ObjectiveTo explore the protective effect and mechanism of the extract of Paris polyphylla on hemorrhagic brain injury in rats.Methods100 healthy SD rats were randomly divided into sham operative group（n＝20），cerebral hemorrhagemodel group（n＝20）and the extract of Paris polyp－h(huán)ylla treatment group（three dirrerent doses at25，50，100mg／kg with 20 rats in each group）according to random number table.Cerebral hemorrhage ratsmodel induced byⅦcollagenase was established.ICH model group and the sham group was given saline，and the treatment group was given different doses of Paris polyphylla extract.The neurological deficit scores ofeach group were evaluated after treatmentat the3rd，5th，7thday.Then six rats were selected and killed in each group at different time point.The level of brain water and SOD in hemorrhage brain tissuewere detected，sowere the content of TNF-αin plasma.ResultsThe neurological deficit scores in model group significantly increased compared with sham group with statistically significant difference（P＜0.01）；compared with model group，groups of low dose，middle dose and high dose significantly decreased neurological deficit scores（P＜0.05，P＜0.01）.SOD activity levels in brain tissue ofmodel group significantly decreased compared with sham group（P＜0.05）；the neurological deficit scores in groups ofmiddle dose and high dose significantly decreased compared with model group with statistically significant difference（P＜0.05）.The level of TNF-αin plasma of themodel group significantly increased compared with sham group at each time point with statistically significantdifference（P＜0.01）.The levelof TNF-αin plasma ofgroups ofmiddle dose and high dose significantly decreased compared with model group（P＜0.05，P＜0.01）.ConclusionThe extract could reduce the scores of neurological deficit scores of collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats，improve the symptoms of cerebral edema，increase the SOD levels in brain tissue，inhibit the oxidation of liposomes，reduce inflammation cytokine of TNF-α，and protect the damaged brain tissue in cerebral hemorrhage rats.

cerebral hemorrhage；Paris polyphylla；rat；protective effect

R453.9

A

1005－1678（2014）09－0061－04

2009年山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃（2009QW003）

周巖方，男，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：顱腦外傷，E-mail：zyf15105868618＠163.com。