李雪琴，張華，陳麗娟

（1.河南鄭州市兒童醫(yī)院兒科，河南鄭州450053；2.鄭州市骨科醫(yī)院脊柱三科，河南鄭州450003；3.南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，江蘇南京210029）

新型STAT3抑制劑齊福斯尼對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

李雪琴1，張華2，陳麗娟3

（1.河南鄭州市兒童醫(yī)院兒科，河南鄭州450053；2.鄭州市骨科醫(yī)院脊柱三科，河南鄭州450003；3.南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，江蘇南京210029）

目的探討新型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抑制劑齊福斯尼（kifocitanib，KIF）對(duì)多發(fā)性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）細(xì)胞系OPM2和U266凋亡及細(xì)胞周期的影響。方法采用臺(tái)盼藍(lán)染色法，檢測(cè)KIF對(duì)OPM2、U266細(xì)胞的存活率及增殖的影響；Annexin V／PI雙染色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果KIF對(duì)OPM2、U266細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴性和時(shí)間依賴性抑制作用，KIF使OPM2、U266細(xì)胞停滯于G0／G1期，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)論KIF阻滯MM細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有抗MM的活性。

STAT3抑制劑；多發(fā)性骨髓瘤；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期

多發(fā)性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）是發(fā)生于B淋巴細(xì)胞的惡性漿細(xì)胞克隆增生性疾病，我國發(fā)病率約1／10萬，多好發(fā)于中老年人群，但近年來數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，其有發(fā)病率增高及發(fā)病年齡提前的趨勢(shì)［1］。目前，臨床治療中多以細(xì)胞毒性藥物、蛋白酶體抑制劑藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物或糖皮質(zhì)激素類藥物進(jìn)行干預(yù)，雖有效地提高了患者的生存期，但藥物的耐藥性及其毒副作用等限制了患者的依從性［2-3］。研究顯示，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在MM中處于異常高表達(dá)和過度活化狀態(tài)［4-5］，因此以STAT3為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物干預(yù)將是抗MM研發(fā)的新方向。本研究以人MM細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討新型STAT3抑制劑齊福斯尼（kifocitanib，KIF）對(duì)MM細(xì)胞凋亡及周期的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 KIF（分子量：336.15），英國Maybrige化學(xué)試劑公司生產(chǎn)；胎牛血清SH30396，RPMI-1640培養(yǎng)基，IMDM培養(yǎng)基，美國HyClone公司生產(chǎn)；碘化丙啶（propidium iodide，PI），美國Sigma公司生產(chǎn)；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒，美國Bio Vision，Inc公司生產(chǎn)。

流式細(xì)胞儀（EPICS?ALTRATM），美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀（SpectraMax M5），美國biotek公司生產(chǎn)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Bechman Counter Z1），美國Thermo公司。

1.2 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng) 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株OPM2、U266由美國多倫多大學(xué)癌癥研究所提供。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，置含5%CO2，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。以O(shè)PM2、U266拒染細(xì)胞作為有活力細(xì)胞，在其比例達(dá)90%以上時(shí)進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。

1.3 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞體外增殖試驗(yàn) 將OPM2，U266細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，1000 r／min離心5 min，加入新鮮培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)稀釋到1.5×105個(gè)／mL，吹打混勻后以終體積0.1 mL接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，KIF藥物母液用IMDM培養(yǎng)基稀釋，分別按藥物濃度梯度0、5、10、15、20、30μM加KIF于96孔板內(nèi)，每個(gè)濃度梯度6個(gè)孔，置5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24、48、72 h將孔板內(nèi)細(xì)胞液吹打混勻，采用臺(tái)盼藍(lán)染色法，計(jì)數(shù)存活細(xì)胞數(shù)，結(jié)果用Excel軟件分析作圖。

1.4 凋亡分析 對(duì)數(shù)生長的OPM2、U266細(xì)胞以6×105個(gè)／mL濃度、終體積0.1mL接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，接種6個(gè)孔，加入0、20μM KIF并置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。1000 r／min離心5min，回收細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞2次后，采用Annexin V／PI雙染色法，100μL的Annexin V-FITC buffer重懸細(xì)胞震蕩后，再分別加Annexin V-FITC和PI混合液1.25μL（兩者等比例濃度混勻后一起加入），再加入300μL Annexin V-FITC buffer終止反應(yīng)。流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞周期分析 對(duì)數(shù)生長的OPM2、U266細(xì)胞以1× 106個(gè)／mL濃度接種于24孔培養(yǎng)板，終體積為1mL，以0、2.5、5、10μM的藥物濃度梯度作用24 h，每個(gè)濃度梯度6個(gè)孔。1000 r／min離心收集細(xì)胞，PBS清洗1遍后，用75%的4℃預(yù)冷乙醇固定，存放于－20℃冰箱。檢測(cè)當(dāng)天，1000 r／min離心2 min去除乙醇，PBS清洗2次。加預(yù)冷的PBS 0.5 mL將細(xì)胞重懸，加入5 μL 10mg／mL的RnaseA，室溫條件下，置暗處反應(yīng)30min后，再加入終濃度為50μg／mL的PI，4℃避光30min，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用Cell Quest軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗(yàn)，樣本率的比較采用卡方檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KIF對(duì)MM細(xì)胞體外增殖的影響 KIF對(duì)OPM2、U266細(xì)胞株體外增殖的劑量及時(shí)間依賴性影響研究結(jié)果顯示，經(jīng)過不同濃度的KIF作用24 h后，OPM2、U266細(xì)胞存活率呈現(xiàn)不同程度的下降，在10μM濃度時(shí)，OPM2、U266細(xì)胞的存活率分別為66%、60%，在30μM濃度時(shí)，OPM2、U266細(xì)胞的存活率分別為35%、29%（見圖1）。

圖1 KIF作用24 h對(duì)MM細(xì)胞體外增殖的劑量依賴性抑制作用Fig.1 Dose-dependent inhibitory effects of KIF on MM cell proliferation in vitro

KIF 10μM作用72 h后細(xì)胞存活率結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在KIF作用72 h后，OPM2、U266細(xì)胞存活率由24 h時(shí)的66%、60%分別下降至11%、12%，見圖2。說明KIF對(duì)OPM2、U266細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴性和時(shí)間依賴性抑制作用。

圖2 10μM KIF對(duì)MM細(xì)胞體外增殖的時(shí)間依賴性抑制作用Fig.2 Time-dependent inhibitory effects of10μM KIF on MM cell proliferation in vitro

2.2 KIF對(duì)MM細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，MM細(xì)胞（OPM2、U266）在經(jīng)KIF 20μM作用24 h后，KIF組的U266的早期凋亡細(xì)胞（FITC＋／PI－，右下象限）占10.96%，高于對(duì)照組的4.23%（χ2＝6.27，P＜0.05）；同時(shí)，KIF組U266的存活細(xì)胞（FITC-／PI-，左下象限）占75.15%，明顯低于對(duì)照組的89.43%（χ2＝3.72，P＜0.05）；KIF組的OPM2細(xì)胞在藥物作用24 h后，凋亡細(xì)胞占3.83%，對(duì)照組為2.27%，差異不明顯，但KIF組的OPM2存活細(xì)胞為72.35%，明顯低于對(duì)照組的90.92%（χ2＝3.39，P＜0.05），結(jié)果說明，KIF具有誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡的作用。另外，KIF作用后，U266和OPM2的晚期凋亡細(xì)胞（FITC＋／PI＋，右上象限）亦高于對(duì)照組（P＜0.05，見圖3）。

圖3 KIF對(duì)U266、OPM2細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of KIF on U266，OPM2 cell apoptosis

2.3 KIF對(duì)MM細(xì)胞周期的影響 KIF對(duì)MM細(xì)胞周期的影響結(jié)果顯示，隨著KIF濃度的增加，處于G0／G1期的OPM2，U266細(xì)胞比例逐漸增加，其中OPM2細(xì)胞由對(duì)照組的58.74%（0μM）逐漸增加到81.08%（10μM）（χ2＝5.64，P＜0.05），U266細(xì)胞由對(duì)照組的49.42%（0μM）增加到67.23%（10μM）（χ2＝4.71，P＜0.05），同時(shí)，處于S期的OPM2，U266細(xì)胞比例逐漸降低，其中OPM2細(xì)胞由對(duì)照組的22.00%（0μM）減少到4.60%（10μM）（χ2＝13.50，P＜0.05）；同時(shí)，U266細(xì)胞由對(duì)照組的23.60%（0μM）減少到6.79%（10μM）（χ2＝9.83，P＜0.05）。由此可見，OPM2，U266細(xì)胞在G0／G1期所占比例隨藥物濃度增加而增加（見圖4，5）。

圖4 KIF對(duì)OPM2細(xì)胞周期的影響Fig.4 Effect of KIF on OPM2 cell cycle

圖5 KIF對(duì)U266細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effect the KIF on U266 cell cycle

3 討論

STAT3是一類非跨膜型的酪氨酸激酶，在細(xì)胞外來信號(hào)的刺激下，通過配體與膜上受體的結(jié)合，參與細(xì)胞表面受體信號(hào)的轉(zhuǎn)錄和核內(nèi)調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)激活。研究顯示，STAT3通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量，顯示出抗腫瘤細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特性［6］。同時(shí)，其可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclin D1、D2、D3，下調(diào)p18和p27等的表達(dá)［7-8］，縮短細(xì)胞在G1期的停滯時(shí)間，快速跨入S期，促進(jìn)細(xì)胞的增殖；STAT3還可增加血管內(nèi)皮生長因子［9］，缺氧誘導(dǎo)因子1α等的表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管的生成［10］。STAT3的這些生物學(xué)活性，使其參與到腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、凋亡、周期等的調(diào)控，腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移以及腫瘤血管的生成等過程。在乳腺癌、前列腺癌等實(shí)體腫瘤以及淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤等惡性血液類腫瘤中均發(fā)現(xiàn)STAT3過表達(dá)和過度活化［11-12］。而抑制STAT3活化的藥物，在阻滯肺癌和乳腺癌等腫瘤中，表現(xiàn)出明顯的抑制腫瘤生長的特性。另外，Jonathan.B的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠骨髓瘤細(xì)胞株中響應(yīng)增加的磷酸化STAT3和上調(diào)Bcl-x1是導(dǎo)致地塞米松抗藥性產(chǎn)生的原因［13］，提示STAT3的異常高表達(dá)與腫瘤的耐藥密切相關(guān)。

MM屬于血液系統(tǒng)惡性腫瘤中相對(duì)高發(fā)性疾病，其發(fā)病率已超過急性白血病，位居血液系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位［14］。分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，STAT3在超過60%的原發(fā)性MM患者骨髓中呈現(xiàn)異常高表達(dá)狀態(tài)［15］?，F(xiàn)有的抗MM藥物由于長期使用，耐藥性和毒副作用較大。因此，以STAT3為靶點(diǎn)，采用相關(guān)抑制劑抑制MM細(xì)胞的增殖將對(duì)MM的治療提出新的思路。目前，S31-201［16］、BP-1-102［17］、OPB-31121［18］等代表性的STAT3抑制劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。KIF是一種新型的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抑制STAT3的小分子活性藥物，它是在計(jì)算機(jī)輔助作用下通過高通量的篩選策略從眾多化合物中所篩選出來的。本研究選取MM細(xì)胞系中最具代表性O(shè)PM2和U266細(xì)胞株為研究對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KIF可誘導(dǎo)MM細(xì)胞的凋亡，這種程序性的細(xì)胞死亡有助于維持MM細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，抑制了MM細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，KIF使多比例的MM細(xì)胞停滯在G0／G1期，這種阻滯細(xì)胞周期的作用最終影響細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)MM細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果再次證實(shí)了國內(nèi)學(xué)者的研究結(jié)果［19］。但在該研究中，研究者還通過體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KIF除抑制腫瘤組織內(nèi)STAT3的表達(dá)活化外，還可對(duì)cyclin D3進(jìn)行抑制，從而調(diào)控細(xì)胞周期，且發(fā)現(xiàn)KIF對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量無影響，且具有較好的口服活性，KIF對(duì)MM表現(xiàn)出良好的體外和體內(nèi)藥效［19］。

綜上所述，STAT3抑制劑KIF可阻滯細(xì)胞周期，使其停滯在G0／G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制MM細(xì)胞的生長和增殖，但其具體的機(jī)制尚在研究中。KIF安全性和治療活性的評(píng)價(jià)尚不明確，因此，其是否可成為治療MM的候選藥物，需進(jìn)一步深入驗(yàn)證。

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（編校：王儼儼）

Effect of a novel STAT3 inhibitor，kifocitanib on multip lemyeloma cell apoptosis and cell cycle

LIXue-qin1，Zhang Hua2，CHEN Li-juan2

（1.Department of Pediatric，Children's Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou 450053，China；2.Third Department of Spine，Zhengzhou Orthopedics 450003；3.School of Basic Medicine，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo explore the influence of the new type signal transducer and activator of transcription 3（STAT3）inhibitors kifocitanib（KIF）on apoptosis and cell cycle ofmultiplemyeloma（MM）cell OPM2 and U266.MethodsThe trypan blue stainingwas used to detect the influence of KIF on survival and proliferation of OPM2，U266 cell；Annexin V／PI double staining and flow cytometry instrument were adopted to measure the effects of KIF on apoptosis rate and cell cycle of OPM2，U266 cell.ResultsKIF inhibited the growth of OPM2，U266 cells，and presented the dose dependent and time dependent inhibition.KIFmade OPM2，U266 cells stagnate in G0／G1 phase，and induced the cell apoptosis.ConclusionKIF inhibits MM cell proliferation，induces MM cell apoptosis，and has resistance to MM cell activity.

STAT3 inhibitors；multiplemyeloma；apoptosis；cell cycle

R453.9

A

1005－1678（2014）09－0014－05

國家自然科學(xué)基金（81071946）

李雪琴，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：新生兒，E-mail：lxq15838348416＠163.com。