師麗娜，臧峰，尤永平

（1.淄博市第一醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，山東淄博255200；2.淄博市第一醫(yī)院普外科，山東淄博255200；3.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京210029）

下調(diào)67LR對U251細(xì)胞系增殖的影響和對MAPK信號通路的作用

師麗娜1，臧峰2Δ，尤永平3

（1.淄博市第一醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，山東淄博255200；2.淄博市第一醫(yī)院普外科，山東淄博255200；3.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京210029）

目的針對67LR設(shè)計高效的shRNA干擾質(zhì)粒研究其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響以及對MAPK信號通路的作用，深入探討67LR蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用。方法首先對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251進(jìn)行培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染，再進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測實驗，并使用Quantitative real-time PCR測定mRNA的表達(dá)量；使用Western blot檢測67LR對MAPK信號通路中蛋白的影響。結(jié)果當(dāng)轉(zhuǎn)染下調(diào)67LR蛋白的干擾質(zhì)粒48 h后，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251增殖能力顯著減弱，與對照組細(xì)胞的增殖能力存在顯著差異。qRT-PCR結(jié)果顯示，下調(diào)67LR的表達(dá)，導(dǎo)致U251細(xì)胞中MKPs變化，并且不同類MKPs的變化情況不一致。Western blot實驗結(jié)果表明在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中，下調(diào)67LR的表達(dá)，導(dǎo)致磷酸化ERK1／2的表達(dá)下降；67LR對PI3K-mTOR信號通路沒有影響。MMP-2是67LR的一個靶基因，在U251細(xì)胞系中，MMP-2參與了由67LR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。結(jié)論在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中，下調(diào)67LR的表達(dá)會引起MMP-2表達(dá)的下降，表明MMP-2是67LR的一個靶基因，在U251細(xì)胞系中，MMP-2參與了由67LR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

膠質(zhì)瘤；增殖；MKPs；MAPKs；67LR；ATRA

層連蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分通過與細(xì)胞表面的層連蛋白受體結(jié)合產(chǎn)生了多種生物學(xué)功能，其中最重要的就是影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖［1］。研究發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞表面的LR主要集中在細(xì)胞的基底面，從而使細(xì)胞黏著于基膜上，而在腫瘤細(xì)胞表面的LR卻散布在整個細(xì)胞表面，而且大多數(shù)沒有與層連蛋白結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞可以結(jié)合更多的層粘連蛋白［2］。大量實驗證明67LR的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的浸潤，轉(zhuǎn)移以及生長密切相關(guān)［3］，高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞往往比低惡性程度的腫瘤表達(dá)更多的67LR與37LRP。Berno等［4］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移機制可能是67LR通過修飾Laminin1，來激活蛋白水解酶，引起外基質(zhì)的降解和腫瘤的轉(zhuǎn)移。除膠質(zhì)瘤以外，其在乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌以及卵巢癌等多種癌癥中也受到了緊密的關(guān)注［5-7］。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞與標(biāo)本 人惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251購自中國科學(xué)院生命科學(xué)研究院；膠質(zhì)瘤標(biāo)本及正常腦組織對照標(biāo)本均取自仁濟醫(yī)院。

1.2 實驗試劑與藥品 混合纖維素酯微孔濾膜（0.22μm），細(xì)胞培養(yǎng)用細(xì)菌過濾器（100mm）（上海百特），6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，35 mm培養(yǎng)皿，60 mm培養(yǎng)皿，15mL無菌尖頭離心管，50mL無菌尖頭離心管（Corning）；

青霉素，鏈霉素，DMEM，胎牛血清，胰蛋白酶，DMSO，poly-D-lysine，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基11995（Gibco）；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent（Roche）；多聚甲醛，TritonX-100，異丙醇，瓊脂糖，氯仿（華美）；DNA Markers（生工?生物工程（上海）有限公司）；TotalRNA Extractor-Trizol（生工?生物工程（上海）有限公司）；PCR DNA Markers，T4 DNA Ligase，StuⅠ酶（TaKaRa公司）；Cell Counting Kit-8（DOJINDO公司）；ECL試劑（Millipore公司）；Western及IP細(xì)胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；DH5α感受態(tài)細(xì)菌（TIANGEN）；質(zhì)粒小抽試劑盒（TIANGEN）；一抗：兔抗人ERK1／2，p38，JNK，磷酸化ERK1／2，磷酸化p38以及磷酸化JNK；多克隆抗體（Cell Signaling）

1.3 方法

1.3.1 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染［8］：將含細(xì)胞的凍存管從－80℃冰箱或液氮中取出，立即置于40℃水浴中輕輕振蕩1min左右，使凍存液溶解，從水浴中拿出，噴灑70%乙醇后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入5mL細(xì)胞培養(yǎng)基中，離心收集細(xì)胞沉淀，加培養(yǎng)基混勻，移入培養(yǎng)皿中。37℃，5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，更換新培養(yǎng)液；加入2mL新鮮培養(yǎng)液，用槍輕輕吹打，再加入適量培養(yǎng)液以易于混勻細(xì)胞；取1mL細(xì)胞懸液加入裝有2mL新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)皿中，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約3 d左右傳代1次；從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，并吸凈培養(yǎng)基，再將已孵育好的復(fù)合物加入到每一個待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的孔中，每孔50μL，輕輕前后搖動培養(yǎng)板混合。細(xì)胞在37℃，5%CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)48 h，觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果并拍攝熒光以及常光照片。

1.3.2 細(xì)胞增殖檢測實驗：在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL／孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37℃，5%CO2）；待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時，使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent進(jìn)行轉(zhuǎn)染；48 h后，取出培養(yǎng)板，向每孔中加入6.5μL的CCK-8溶液；將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育4 h；用酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光度［9］。

1.3.3 Quantitative real-time PCR：將總RNA溶液吸取1～2μL置于Nanodrop 2000的探頭上，閉合探頭，開始測定，得到260nm和280nm波長分別測吸光值（A）與A260／A280的值以及RNA溶液的濃度；使用Graph Prism 5.0軟件計算mRNA的相對表達(dá)量［10］。

1.3.4 Western blot：用PBST清洗封閉后的膜4次，每次5min，盡量不要有殘余物；加入一抗室溫孵育2 h后，用PBST清洗3次，每次5min；加入二抗室溫孵育1 h后，用PBST清洗3次，每次5min；顯色：取ECL試劑盒中試劑A和試劑B各500μL，混勻后，潤濕膜，使其反應(yīng)1min；將膜放入壓片盒中，用X感光片感光約5～60 s。經(jīng)顯影、停影、定影和水洗后，晾干［11］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果用Graph Prism 5.0軟件定量分析。采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)采用單因素方差分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤與正常人腦組織中67LR表達(dá) 實驗結(jié)果如圖1，結(jié)果表明惡性膠質(zhì)瘤切片上的染色顆粒比正常人腦組織顏色明顯較深，密集程度也明顯較高。

圖1 正常人腦組織切片和惡性腦膠質(zhì)瘤切片的67LR免疫組化染色Fig.1 67LR immunohistochemical staining of normal human brain tissue and malignant brain glioma sections

2.2 67LR干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞 67LR干擾質(zhì)粒（pSC-67LR）、亂序?qū)φ召|(zhì)粒（pSC-SV）由本實驗室構(gòu)建。pSC-67LR、pSCSV與pEGFP-C1質(zhì)粒以質(zhì)粒濃度3∶1共轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞48 h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量明亮的綠色熒光，其中A圖為未做任何處理的空白對照；B圖為共轉(zhuǎn)染pSC-SV與pEGFP-C1質(zhì)粒48 h后，U251細(xì)胞的常光照片；C圖為B圖相同視野下的熒光照片；D圖為共轉(zhuǎn)染pSC-67LR與pEGFP-C1質(zhì)粒48 h后，U251細(xì)胞的常光照片；E圖為D圖相同視野下的熒光照片（如圖2）。

圖2 pSC-67LR質(zhì)粒與pEGFP-C1質(zhì)粒、pSC-SV質(zhì)粒與pEGFP-C1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251A：空白對照；B：共轉(zhuǎn)染pSC-SV與pEGFP-C1質(zhì)粒48 h后，U251細(xì)胞的常光照片；C：B圖相同視野下的熒光照片；D：共轉(zhuǎn)染pSC-67LR與pEGFP-C1質(zhì)粒48 h后，U251細(xì)胞的常光照片；E：D圖相同視野下的熒光照片F(xiàn)ig.2 The brain glioma cell line U251 transfected by pSC-67LR plasmid and pEGFP-C1 plasmid，pSC-SV plasmid and pEGFP-C1 plasmidA：blank control group；B：48 h after co-transfection of pSC-SV and pEGFP-C1 plasmid，U251 cell constant light photo；C：fluorescence photo under the same vision of Fig.B；D.48 h after co-transfection of pSC-67LR and pEGFP-C1 plasmid，U251 cell constant light photo；E：fluorescence photo under the same vision of Fig.D

2.3 Western blot分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中67LR蛋白的表達(dá)變化

結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pSC-67LR質(zhì)粒組中67LR的蛋白表達(dá)量顯著低于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pSC-SV質(zhì)粒對照組（P＜0.01）。qRT-PCR與Western blot的結(jié)果表明，pSC-67LR質(zhì)粒能夠有效地下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中67LR的表達(dá)。如圖3，A圖為Western blot分析轉(zhuǎn)染pSC-67LR質(zhì)粒48 h后，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中67LR的蛋白表達(dá)變化，β-actin為內(nèi)參，Con為空白對照組，SV為轉(zhuǎn)染pSCSV質(zhì)粒的對照組，si67lr為轉(zhuǎn)染了pSC-67LR質(zhì)粒的實驗組；B圖是A圖的灰度統(tǒng)計結(jié)果。

圖3 Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞系67LR的蛋白表達(dá)變化**P＜0.01，與空白對照組比Fig.3 Changes of67LR protein expression in transfected cell line by Western blot **P＜0.01，compared with control group

2.4 67LR表達(dá)下調(diào)抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251的增殖能力 使用CCK-8試劑盒對U251細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行檢測，酶標(biāo)儀檢測得到OD數(shù)值，經(jīng)過Prism 5.0軟件標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到結(jié)果并對細(xì)胞進(jìn)行對照，實驗組與對照組的細(xì)胞增殖能力存在顯著差異（P＜0.001）?？瞻讓φ战M的OD值為（2.12±0.13），轉(zhuǎn)染pSC-SV質(zhì)粒對照組OD值為（1.87±0.18），轉(zhuǎn)染pSC-67LR質(zhì)粒實驗組OD值為（1.43±0.21）。

2.5 qRT-PCR檢測67LR對MKPs的影響 分別從4類MKPs中各選取一個成員進(jìn)行研究。分別是：MKP-1（選擇性的去磷酸化所有MAPKs）；MKP-3（選擇性地去磷酸化ERKs）；MKP-5（選擇性的去磷酸化JNK和p38）；PAC1（選擇性地去磷酸化ERKs和p38）［12］。轉(zhuǎn)染48 h，Trizol提取腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其作為模板，用MKP-1，MKP-3，MKP-5以及PAC1的特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pSC-67LR質(zhì)粒的U251細(xì)胞中MKP-1，MKP-3和MKP-5的mRNA表達(dá)量明顯高于對照組中mRNA表達(dá)量。但是PAC-1的表達(dá)量卻出現(xiàn)了顯著的下降。如圖4，A圖為空白對照組細(xì)胞照片；B圖為轉(zhuǎn)染pSC-SV質(zhì)粒的對照組細(xì)胞照片；C圖為轉(zhuǎn)染pSC-67LR質(zhì)粒的實驗組細(xì)胞照片（圖中標(biāo)尺均為50μm）；D圖為CCK-8試劑盒檢測下調(diào)67LR后U251細(xì)胞增殖能力，Con為空白對照組，SV為轉(zhuǎn)染pSC-SV質(zhì)粒的對照組，si67lr為轉(zhuǎn)染pSC-67LR質(zhì)粒的實驗組（P＜0.001）。

圖4 轉(zhuǎn)染pSC-67LR質(zhì)粒48 h后，U251細(xì)胞系的增殖情況Fig.4 48 hours after pSC-67LR gene transfection，proliferation of U251 cell line

2.6 Western blot檢測67LR對MAPK信號通路中蛋白的影響 為研究下調(diào)67LR抑制細(xì)胞增殖的分子機制，檢測MAPK信號通路中ERK1／2，p-ERK1／2，p38，p-p38，SAPK／JNK與p-SAPK／JNK的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染pSC-67LR質(zhì)粒48 h之后，抽提腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Western blot實驗。如圖5，Con為空白對照組，SV為轉(zhuǎn)染pSC-SV質(zhì)粒的對照組，si67lr為轉(zhuǎn)染pSC-67LR質(zhì)粒的實驗組。A圖為Western blot分析轉(zhuǎn)染67LR RNA干擾質(zhì)粒48 h后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中MAPKs各蛋白與磷酸化MAPKs各蛋白的表達(dá)變化。β-actin為內(nèi)參；B圖為A圖中ERK1／2，p38與SAPK／JNK總蛋白表達(dá)情況的灰度分析；C圖為A圖中p-ERK1／2，p-p38與p-SAPK／JNK蛋白表達(dá)情況的灰度分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了pSC-67LR質(zhì)粒的細(xì)胞中，磷酸化ERK1／2明顯降低（P＜0.05），但是磷酸化p38以及磷酸化SAPK／JNK并沒有顯著的變化。提示在抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖的過程中ERK1／2發(fā)揮了重要的作用，說明MAPK信號通路參與了下調(diào)67LR后，抑制腫瘤細(xì)胞增殖的過程。

圖5 Western blot分析MAPK信號通路中各蛋白的總量與磷酸化后各蛋白表達(dá)的變化Fig.5 Western blot analysis of the change of the total protein expression and each protein expression in the MAPK signaling pathway after phosphorylation

2.7 Western blot分析下調(diào)67LR對MMP-2與p-mTor的影響 為研究下調(diào)67LR對MMP-2的影響，以及67LR對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控過程中是否涉及PI3K信號通路，使用Western blot檢測了轉(zhuǎn)染pSC-67LR質(zhì)粒48 h后，人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中，MMP-2與p-mTor的表達(dá)情況。Western blot檢測轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒細(xì)胞系U251中MMP-2與磷酸化mTor蛋白表達(dá)變化。Con為空白對照組，SV為轉(zhuǎn)染pSC-SV質(zhì)粒的對照組，si67lr為轉(zhuǎn)染pSC-67LR質(zhì)粒的實驗組，β-actin為內(nèi)參。

圖6 Western blot檢測轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒細(xì)胞系U251中MMP-2與磷酸化mTor蛋白表達(dá)變化Fig.6 Expression of MMP-2 and phosphorylated mTor protein in interference plasmid transfected U251 cell line by Western blot

3 討論

MAPK信號通路中的3種主要蛋白依靠磷酸化與去磷酸化來調(diào)節(jié)自身的激活與失活，從而對細(xì)胞的生理功能進(jìn)行調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)［13］，磷酸酶的催化能力是激酶的100～1000倍，這是因為磷酸酶催化不需要ATP供能，屬于直接反應(yīng)，但是激酶催化需要消耗ATP，因此磷酸酶對信號通路的調(diào)節(jié)可能較激酶更有效率。而可以導(dǎo)致其失活的磷酸酶即為MKPs（MAPK磷酸酶）。根據(jù)MKPs作用底物的不同又可以將其分為4類，在本研究中選取了4類中的代表進(jìn)行分析：選擇性去磷酸化ERKs的MKP-3，選擇性去磷酸化JNK和p38的MKP-5，去磷酸化所有的MAPKS的MKP-l以及選擇性去磷酸化ERKs和p38的PAC1。qRT-PCR結(jié)果表明，除了PAC1之外，其余3種MKPs的mRNA表達(dá)上調(diào)，說明67LR對MKPs的調(diào)控機制不同，但是對同一類MKPs的調(diào)控機制是否一致，需要進(jìn)一步深入研究。MKPs家族共有11個成員，每個成員都會特異選擇一種或幾種蛋白進(jìn)行去磷酸化作用［14］。本實驗檢測了MKP-1，MKP-3，MKP-5與PAC1 4種MKPs的mRNA表達(dá)變化，結(jié)果顯示MKP-5與PAC1的mRNA相對表達(dá)量非常低，推測不同MKPs在細(xì)胞中的含量不同對MAPK通路中各蛋白的調(diào)控能力也不同。在本研究中，正常人腦組織切片和惡性腦膠質(zhì)瘤切片的67LR免疫組化染色結(jié)果表明67LR在惡性膠質(zhì)瘤組織切片的表達(dá)量高于正常人腦組織切片。同時，使用CCK-8試劑盒對U251細(xì)胞的增殖能力檢測實驗結(jié)果顯示，對照組中活細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞的增殖能力較強，實驗組細(xì)胞增殖能力的減弱。Western blot結(jié)果顯示磷酸化ERK1／2的表達(dá)出現(xiàn)明顯下降，而磷酸化p38與磷酸化SAPK／JNK的表達(dá)沒有發(fā)生明顯變化，說明67LR通過調(diào)控ERK1／2的激活，影響腫瘤細(xì)胞的生理功能。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲／蘇氨酸蛋白激酶，屬于細(xì)胞中另外一條經(jīng)典的信號通路：PI3K信號通路，它在細(xì)胞生長、增殖、分化、細(xì)胞周期調(diào)控等多個方面起到重要作用，而mTOR抑制劑能夠抑制由于該信號通路異常引起的癌基因的轉(zhuǎn)化、腫瘤的生長和腫瘤血管生成。說明mTOR在腫瘤生長過程中起到非常重要的作用。基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrixmetallo proteinase-2，MMP-2）作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一員在降解ECM中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障以及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用，從而在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用日益受到重視。由于67LR對腫瘤的生長、增殖同樣起到重要作用［15］，本研究通過Western blot的方法檢測在轉(zhuǎn)染了67LR RNA干擾質(zhì)粒的U251細(xì)胞中磷酸化mTOR的表達(dá)。實驗結(jié)果表明，67LR表達(dá)變化并不影響磷酸化mTOR的表達(dá)，說明67LR對于腫瘤細(xì)胞的調(diào)控并不是通過mTOR信號通路進(jìn)行。由于MMP-2作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一員在降解ECM中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障以及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。因此本研究檢測了下調(diào)67LR后MMP-2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中，下調(diào)67LR的表達(dá)會引起MMP-2表達(dá)的下降，表明MMP-2是67LR的一個靶基因，在U251細(xì)胞系中，MMP-2參與了由67LR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

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［13］歐陽樂平，張善義，李軍亮，等.過表達(dá)TAP1上調(diào)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251 HLA-I的表達(dá)［J］.中國病理生理雜志，2013，29（3）：425-429.

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（編校：譚玲，秦曉英）

Effect of down-regulation of 67LR on the proliferation of U251 cell line and MAPK signal pathway

SHILi-na1，ZANG Feng2Δ，YOU Yong-ping3

（1.Department of Medical Services，The First Hospital of Zibo，Zibo 255200，China；2.Department of General Surgery，The First Hospital of Zibo，Zibo 255200，China；3.Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo study the effects of efficient shRNA interference plasmid designed for67LR，its impacton glioma cell proliferation aswell as to the role of MAPK signal pathway，and discuss the role of 67LR proteins in glioma cells.MethodsU251 glioma cell line was cultivated and transfected firstly，then cell proliferation was detected，and mRNA expression wasmeasured by Quantitative real-time PCR；67LR was detected on the impact of protein in the MAPK signal pathway by Western blot.ResultsWhen 48 hours after the down-regulation of67LR protein interference plasmid transfection，malignant glioma cell line U251 proliferation ability reduced significantly，which had the significantdifferencewith controlgroup.qRT-PCR results showed that，down-regulation of 67LR expression led to the change of MKPs in U251 cells，and the changes were not same of different MKPs. Western blot results showed that in U251 glioma cells，down-regulation of 67LR expression led to the decline in the expression of the phosphorylation ERK1／2；67LR had no effect on PI3K-mTOR signal pathways.MMP-2 as a target gene，in U251 cell line，MMP-2 participated in the 67 LR mediated signal transduction pathways.Conclusion In brain glioma U251 cell line，down-regulation of67LR expression could lead to the decline in the expression of MMP-2，which shows thatMMP-2 is a target gene.In U251 cell line，MMP-2 participates in the signal transduction pathwaysmediated by 67LR.

glioma；proliferation；MKPs；MAPKs；67LR；ATRA

R739.41

A

1005－1678（2014）08－0084－04

國家自然科學(xué)基金（81072078）

師麗娜，女，主治醫(yī)師，研究方向：血液病學(xué)，E-mail：qch1821460063＠163.com；臧峰，通信作者，男，研究生，主治醫(yī)師，研究方向：血液病學(xué)E-mail：qch1821460064＠163.com。