王雪艷，蔣棟，費(fèi)然，魏來，陳紅松

（北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京大學(xué)肝病研究所 丙型肝炎和肝病免疫治療北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044）

兩種乙型肝炎病毒恩替卡韋耐藥突變株質(zhì)粒的構(gòu)建及其病毒學(xué)特征分析

王雪艷，蔣棟，費(fèi)然，魏來，陳紅松Δ

（北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京大學(xué)肝病研究所 丙型肝炎和肝病免疫治療北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044）

目的構(gòu)建乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）恩替卡韋耐藥突變株表達(dá)質(zhì)粒并對其體外復(fù)制病毒學(xué)特征進(jìn)行研究。方法以含1.2倍HBV DNA全基因的質(zhì)粒pUC-HBV1.2-WT為模板，應(yīng)用PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)構(gòu)建恩替卡韋耐藥突變株質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，建立HBV體外復(fù)制細(xì)胞模型，分析耐藥突變株復(fù)制水平及表達(dá)活性。結(jié)果成功構(gòu)建恩替卡韋耐藥突變株表達(dá)質(zhì)粒pETV1（rtL180M＋M204V＋I(xiàn)169T＋M250V）和pETV2（rtL180M＋M204V＋T184G＋S202I）。HBV體外復(fù)制細(xì)胞模型培養(yǎng)上清可檢測到HBsAg和HBeAg及HBV DNA，細(xì)胞內(nèi)可檢測到HBV復(fù)制中間體；耐藥突變株復(fù)制能力分別為野生株的47.4%和38.6%。結(jié)論成功構(gòu)建乙型肝炎病毒恩替卡韋耐藥突變株表達(dá)質(zhì)粒。不同突變形式的ETV耐藥突變株體外復(fù)制能力較野生株下降。

乙型肝炎病毒；恩替卡韋；耐藥；質(zhì)粒

盡管存在有效的疫苗接種預(yù)防措施，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染仍然在全球范圍內(nèi)廣泛分布并且可能導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。據(jù)世界衛(wèi)生組織2012年更新的相關(guān)資料顯示，全球約20億人曾感染過HBV，2.4億慢性感染者，每年約有60萬人死于急性或慢性HBV感染所致疾病［1］。我國屬乙型肝炎高發(fā)區(qū)，2006年全國人群乙肝血清流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，乙肝疫苗預(yù)防接種工作的開展已使得我國一般人群HBV表面抗原（HBsAg）攜帶率從1992年的9.75%下降為7.18%［2-3］。但是我國人口眾多，據(jù)此推算，我國仍有乙肝表面抗原攜帶者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者約3000萬［4］。

有效的抗病毒治療可延緩CHB患者的肝臟疾病進(jìn)程和減少死亡率［5］。目前臨床藥物主要為2種干擾素（Interferon，IFN）和5種核苷（酸）類似物（nucleoside／nucleotide analogs，NAs）［6］。NAs藥物具有服用方便、抑制病毒復(fù)制能力強(qiáng)、副作用較小等優(yōu)點(diǎn)，已成為臨床首選。5種NAs分別為：拉米夫定（lamivudine，LAM）、阿德福韋酯（adefovir dipivoxil，DV）、替比夫定（telbivudine，LdT）、恩替卡韋（entecavir，ETV）和替諾福韋（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）。

ETV可強(qiáng)效抑制HBV復(fù)制且具有高耐藥基因屏障，是目前國內(nèi)外CHB治療臨床指南推薦的一線抗病毒藥物［7-8］。ETV是在LAM耐藥位點(diǎn)rtM204I／V±rtL180M的基礎(chǔ)上產(chǎn)生rtT169，rtT184，rtS202，或者rtM250位點(diǎn)的突變［9］。為研究恩替卡韋耐藥HBV突變株的復(fù)制水平及表達(dá)活性，本研究旨在通過構(gòu)建含有上述突變位點(diǎn)的質(zhì)粒并瞬時轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系，建立HBV體外復(fù)制模型，分析耐藥突變對病毒復(fù)制與表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞 pUC-HBV1.2-WT含1.2倍拷貝HBV全基因（基因型B，Genbank引入號為AY518556），可在肝癌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制表達(dá)［10］。人肝癌細(xì)胞系HepG2在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)用含10%胎牛血清的DMEN／F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。質(zhì)粒及細(xì)胞均由北京大學(xué)肝病研究所保存。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清和DMEM／F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，NucleoSpin Extract質(zhì)粒凝膠回收試劑盒和NucleoBond PC EF無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取純化試劑盒購自德國MN公司，真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑FuGENE HD購自德國Roche公司，各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶及DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)均購自美國NEB公司，HBV DNA熒光實(shí)時定量PCR試劑盒購自深圳凱杰生物工程有限公司，蛋白酶K購自美國Invitrogen公司，地高辛探針標(biāo)記試劑盒、堿性磷酸酶抗地高辛抗體和CDP-Star試劑盒購自德國Roche公司。HBV核酸定量檢測試劑盒購自深圳凱杰公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增 按照pUC-HBV1.2-WT中HBV DNA序列，通過Primer 5.0軟件分析設(shè)計(jì)引物，在相應(yīng)位置引入突變位點(diǎn)。引物由上海生工公司合成，引物名稱和序列如下（見表1）。以rtL180M突變位點(diǎn)為例，以質(zhì)粒pUC-HBV1.2-WT為模板，用引物F和rtL180M R1及引物rtL180M F1和R進(jìn)行引物分段擴(kuò)增，分別獲得1091 bp和403 bp大小片段。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并通過凝膠回收純化試劑盒回收純化片段。將上述兩步擴(kuò)增產(chǎn)物純化片段混合作為第2輪PCR反應(yīng)模板，以引物F和R進(jìn)行重疊延伸法獲得含有rtL180M長度為1446 bp的片段。

表1 定點(diǎn)誘變PCR所用引物Tab.1 Primers used for site-directed mutagenesis

1.2.2 突變克隆篩選及鑒定 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行A-T克隆，EcoR I限制性酶切和DNA測序篩選含有預(yù)期突變的陽性克隆。以限制性內(nèi)切酶雙酶切陽性克隆和pUC-HBV1.2-WT質(zhì)粒，電泳分離后將切膠回收目的片段進(jìn)行連接、并轉(zhuǎn)化挑取單克隆進(jìn)行酶切和測序鑒定。以此類推，同樣方法進(jìn)行其他位點(diǎn)突變。

1.2.3 瞬時轉(zhuǎn)染 通過NANODROP 2000紫外分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)粒濃度定量。按照FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，I型鼠尾膠原包被6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，HepG2細(xì)胞融合至90%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔轉(zhuǎn)染2μg目的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后72 h收集培養(yǎng)細(xì)胞及上清。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg和HBeAg檢測 通過全自動酶免分析儀ARCHITECT-i2000及其配套試劑產(chǎn)品，采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測方法測定HBsAg和HBeAg。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)上清HBV DNA檢測 應(yīng)用DNase I消化細(xì)胞培養(yǎng)上清中質(zhì)粒DNA，37℃孵育1 h，按照HBV核酸定量檢測試劑盒說明書，使用LightCycler?II PCR儀（Roche公司，美國）進(jìn)行HBV DNA熒光定量PCR。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體檢測 用PBS沖洗2次細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液充分裂解，振蕩后4℃靜置15min，12000 g離心5min收集上清，DNase I消化外源質(zhì)粒，加入蛋白酶K裂解液60℃裂解1 h；酚／氯仿抽提2次，乙醇沉淀后溶于20μL含RNase A的TE緩沖液。將提取的HBV DNA進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳，堿變性后虹吸轉(zhuǎn)膜過夜，紫外交聯(lián)后用含25 ng／mL地高辛探針的雜交液雜交過夜，封閉后按1∶10000加入抗地高辛抗體，室溫孵育30 min，洗膜后加入CDP-Star試劑，壓片曝光顯影，掃描膠片，用Quantity One軟件進(jìn)行條帶的相對灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)計(jì)量資料以“±s”表示。

2 結(jié)果

2.1 恩替卡韋耐藥質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 以野生株HBV復(fù)制質(zhì)粒pUC-HBV1.2-WT為模板，利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建得到恩替卡韋耐藥突變株表達(dá)質(zhì)粒，分別命名為pETV1（含位點(diǎn)rtL180M＋M204V＋I(xiàn)169T＋M250V）和pETV2（含位點(diǎn)rtL180M＋M204V＋T184G＋S202I）。質(zhì)粒經(jīng)酶切（見圖1）和測序鑒定（見圖2），顯示引入突變位點(diǎn)正確。野生株、pETV1和pETV2突變質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和HindⅢ雙酶切后產(chǎn)生1.2倍HBV全長基因（3800 bp）和pUC18載體片段（2686 bp）。

圖1 野生株和恩替卡韋耐藥突變質(zhì)粒EcoR I和HindⅢ雙酶切鑒定Fig.1 Identification ofwild-type and entecavir-resistant plasmids in the EcoR I／HindⅢdigestion

圖2 恩替卡韋耐藥質(zhì)粒突變位點(diǎn)測序驗(yàn)證Fig.2 Validation of entecavir-resistant plasmids by DNA sequencing

2.2 抗原表達(dá)及病毒復(fù)制水平 野生型和突變型HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞72 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中均存在高水平的HBsAg、HBeAg表達(dá)和HBV DNA復(fù)制（見表2），證明突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系能夠建立HBV體外復(fù)制，可向細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌成熟病毒顆粒及抗原。

表2 野生株和恩替卡韋耐藥株細(xì)胞上清中HBsAg、HBeAg和HBV DNA定量檢測結(jié)果Tab.2 Quantitative analysis of HBsAg，HBeAg and HBV DNA levels in culturemedia from wild-type and entecavir-resistantmutant strains

2.3 HBV突變株病毒復(fù)制能力 轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞72 h后，用Southern blotting方法檢測野生株和恩替卡韋耐藥株HBV復(fù)制中間體，可見耐藥株較野生株復(fù)制水平下降，pETV1和pETV2 HBV復(fù)制水平分別為野生株的47.4%和38.6%（見圖3）。

圖3 Southern blotting檢測野生株和恩替卡韋耐藥株細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體Fig.3 Analysis of replicative intermediate ofwild-type and entecavir-resistant HBV DNA by Southern blotting

3 討論

NAs用于臨床抗病毒治療使得大量CHB患者受益，其作用靶點(diǎn)為HBV逆轉(zhuǎn)錄酶，它們在體內(nèi)被細(xì)胞激酶轉(zhuǎn)化為三磷酸鹽活性形式，與天然核苷酸底物相互競爭參與DNA鏈的延長。L型核苷類（拉米夫定）和無環(huán)磷酸鹽類（阿德福韋和替諾福韋）NAs由于3′端缺少-OH導(dǎo)致HBV DNA鏈合成的終止。恩替卡韋為D型環(huán)戊烷（烯）類NAs，具備高效的抑制病毒復(fù)制和細(xì)胞內(nèi)磷酸化，作用于HBV聚合酶啟動、前基因組mRNA逆轉(zhuǎn)錄成HBV負(fù)鏈DNA以及HBV正鏈DNA合成的3個環(huán)節(jié)。恩替卡韋與L型核苷類不同的是，當(dāng)其以活性磷酸鹽形式摻入DNA鏈后允許核苷酸繼續(xù)加入，DNA鏈為減輕空間張力產(chǎn)生變形或封閉dNTP結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致DNA鏈終止，從而干擾DNA合成［11］。

NAs長期應(yīng)用使得耐藥突變株獲得選擇性擴(kuò)增，替代野生株成為優(yōu)勢株，從而導(dǎo)致臨床耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)。耐藥已成為CHB抗病毒治療過程中最重要的問題之一。藥物的耐藥基因屏障是指引起病毒對藥物敏感性下降所需的病毒基因組位點(diǎn)突變數(shù)目。LAM、ADV和LdT只需1個原發(fā)耐藥位點(diǎn)突變即可產(chǎn)生耐藥，是低耐藥基因屏障藥物。ETV需同時出現(xiàn)3個氨基酸位點(diǎn)突變才導(dǎo)致藥物敏感性下降，是高耐藥基因屏障藥物［9］。臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，對于初治CHB患者，LAM治療5年的耐藥率為70%，ADV治療5年的耐藥率為29%，LdT治療3年的耐藥率為34%，ETV治療6年的耐藥率僅為1.2%，而TDF治療6年沒有發(fā)現(xiàn)耐藥現(xiàn)象［12-16］。ETV對HBeAg陽性或陰性患者均能有效抑制病毒復(fù)制，但在LAM耐藥基礎(chǔ)上再出現(xiàn)1個突變位點(diǎn)即可產(chǎn)生ETV耐藥。LAM耐藥患者用ETV單藥治療5年，耐藥發(fā)生率高達(dá)51%［17］，因此對于ETV的表型耐藥應(yīng)有更深入的研究。

本研究以含1.2倍拷貝全長HBV基因組質(zhì)粒為模板，運(yùn)用PCR點(diǎn)誘變技術(shù)成功構(gòu)建了2種含有恩替卡韋耐藥突變位點(diǎn)的表達(dá)質(zhì)粒，并以此耐藥質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系，建立了具有完整病毒復(fù)制和抗原表達(dá)的HBV體外復(fù)制模型。本文構(gòu)建的質(zhì)粒是在rtL180M＋M204V基礎(chǔ)上出現(xiàn)rtI169T＋M250V或者rtT184G＋S202I位點(diǎn)的突變，突變株的復(fù)制能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生株，說明這些位點(diǎn)的突變使得HBV復(fù)制能力受損，為進(jìn)一步分析HBV表型耐藥及交叉耐藥提供研究工具及相關(guān)信息。

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（編校：吳茜）

Construction of entecavir-resistant hepatitis B virusmutant p lasm ids and its virological characteristics

WANG Xue-yan，JIANG Dong，F(xiàn)EIRan，WEILai，CHEN Hong-songΔ

（Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases，Hepatology Institute of Peking University People's Hospital，Beijing 100044，China）

ObjectiveTo construct entecavir-resistance mutant plasmids of hepatitis B virus with replication competence，and study their replication capacity in transiently transfected HepG2 cells.MethodsThe plasmid containing the entire HBV（1.2 copies）genomewas used to construct objective plasmids via PCR-based site-directed mutagenesis in vitro.The constructed plasmids were validated by DNA sequencing.After transiently transfected into HepG2 cells，HBsAg and HBeAg in supernatants were measured by ELISA，HBV DNA levels in supernatants and Intracellular HBV replicative intermediates were measured by Real-time PCR and Southern blotting respectively.ResultsPlasmids containing entecavir resistance mutations pETV1（rtL180M＋M204V＋I(xiàn)169T＋M250V）and pETV2（rtL180M＋M204V＋T184G＋S202I）were constructed and expressed in HepG2 cells.HBsAg，HBeAg and HBV DNA in supernatantsweremeasured.Entecavir-resistant HBV strains showed decline of replication capacities，which were equal to 47.4%and 38.6%of wild type HBV.Conclusion Entecavir-resistance mutant plasmids of hepatitis B virus are constructed.Various entecavir-resistant HBV show a lower replicative competence compared to wild-type strain in vitro.

hepatitis B virus；entecavir；drug-resistance；plasmid

R512.62

A

1005－1678（2014）08－0053－04

北京大學(xué)人民醫(yī)院研究與發(fā)展基金項(xiàng)目（RDB2013－02）

王雪艷，女，博士，副教授，研究方向：肝病，E-mail：wxy2024＠126.com；陳紅松，通信作者，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：肝病，E-mail：chenhongsong2999＠163.com。