張 科 邰智慧 李淑英 杜海軍 李勁濤 朱麗華 趙 瑩 張?jiān)迫?周 玲 曾 毅

(河北聯(lián)合大學(xué)繼續(xù)教育學(xué)院，河北 唐山 063000)

EB病毒(EBV)是DNA腫瘤病毒，與多種人類(lèi)惡性腫瘤有關(guān)。近年來(lái)研究表明EBV 感染與胃癌的發(fā)生有關(guān)〔1，2〕，一般認(rèn)為超過(guò)80%的淋巴上皮瘤樣胃癌都有EBV感染,而不同胃癌中,EBV感染表達(dá)的基因不同〔3，4〕。本研究以EBV感染體外培養(yǎng)的不同分化程度的胃癌細(xì)胞系，分析EBV感染細(xì)胞中EBV編碼核抗原EBNA1、EBNA2、潛伏感染膜蛋白LMP1、LMP2A、裂解感染早期基因BARF1、晚期基因BLLF1及BcLF1的表達(dá)狀況，探討EBV對(duì)不同分化程度胃癌細(xì)胞的易感性及EBV相關(guān)胃癌發(fā)生可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 B95-8細(xì)胞、低分化前胃癌細(xì)胞株(BGC823)、低分化胃癌細(xì)胞株(MKN45)及高分化胃腺癌細(xì)胞(MKN28)本室保存。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液及小牛血清及2倍Power Taq PCR Master Mix均購(gòu)于北京百泰克生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用RPMI1640培養(yǎng)液(添加10%滅活的小牛血清，100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)常規(guī)培養(yǎng)B95-8細(xì)胞；用DMEM培養(yǎng)液(添加10%滅活的小牛血清，100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)常規(guī)培養(yǎng)BGC823、MKN45及MKN28細(xì)胞，每2～3天換液1次。

1.2.2EBV制備 用攜帶EBV的B95-8細(xì)胞系制備EBV：用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)B95-8細(xì)胞濃度為5×105/ml，置33℃培養(yǎng)11 d，取培養(yǎng)上清經(jīng)0.45 μm濾器過(guò)濾后，10 000 r/min，4℃離心2 h，棄去90%的上清液，制備成10倍濃縮的EBV懸液，分裝貯存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank提供的EBV基因組序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物設(shè)計(jì)后，委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。見(jiàn)表1。

1.2.4EBV感染 實(shí)驗(yàn)所用BGC823、MKN45及MKN28細(xì)胞株為EBV陰性。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的3種細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)細(xì)胞/ml，當(dāng)50% 細(xì)胞發(fā)生匯合時(shí)，加入EBV懸液(使EBV與細(xì)胞培養(yǎng)液終濃度比為1∶10)繼續(xù)培養(yǎng)4 d，然后加入無(wú)EBV的細(xì)胞培養(yǎng)液傳代，每2天換液1次。

1.2.5細(xì)胞形態(tài)觀察 將感染EBV的3種胃癌細(xì)胞分別置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，以非感染EBV的3種胃癌細(xì)胞作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.2.6感染細(xì)胞各種基因表達(dá)狀況的檢測(cè) 將感染EBV的傳代細(xì)胞及未感染EBV的3種胃癌細(xì)胞，分別提取各類(lèi)細(xì)胞RNA，RT-PCR檢測(cè)EBV編碼核抗原EBNA1、EBNA2，潛伏感染膜蛋白LMP1、LMP2A，裂解感染早期基因BARF1，晚期基因BLLF1及BcLF1的表達(dá)狀況，所用引物如表1。

表1 本研究中使用的擴(kuò)增引物

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，未感染EBV的胃癌細(xì)胞株呈梭形，貼壁生長(zhǎng)(圖1)，經(jīng)EBV感染后，梭形細(xì)胞圓化、增大；細(xì)胞核增大，可見(jiàn)1～3個(gè)核仁；胞質(zhì)豐富，并常見(jiàn)有空泡，細(xì)胞呈多形性，細(xì)胞增殖旺盛，貼壁生長(zhǎng)。用胰酶消化細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞對(duì)附著體的黏著力減弱，細(xì)胞相互間的走向失去正常規(guī)律性(圖2)。

2.2感染細(xì)胞各種基因表達(dá)狀況的檢測(cè) 提取細(xì)胞RNA，以RT-PCR檢測(cè)EBV編碼核抗原EBNA1、EBNA2，潛伏感染膜蛋白LMP1、LMP2A，裂解感染早期基因BARF1，晚期基因BLLF1及BcLF1的表達(dá)狀況，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，感染的親代細(xì)胞及傳5代細(xì)胞不表達(dá)EBNA2、LMP1 和LMP2A，但檢測(cè)到EBNA1、BARF1及BcLF1的表達(dá)，其片段大小分別為542 bp、524 bp和349 bp(圖3)，同預(yù)期片段大小一致。

BGC823細(xì)胞

MKN45細(xì)胞

MKN28細(xì)胞

BGC823

MKN45

MKN28

M1:100 bp ladder;Neg陰性對(duì)照;BGC823、 MKN45及MKN28：人低分化前胃癌、低分化胃癌及高分化胃癌細(xì)胞：823/EBV、 45/EBV及28/EBV：EBV感染的細(xì)胞化胃癌細(xì)胞

圖3RT-PCR檢測(cè)EBV感染及未感染細(xì)胞EBNA1、BARF1及BcLF1表達(dá)

3 討 論

BGC823、MKN45及MKN28細(xì)胞株分別來(lái)源于人低分化前胃癌細(xì)胞系、低分化胃癌細(xì)胞系及高分化胃腺癌細(xì)胞系。近年研究表明：胃癌的發(fā)生與EBV感染有關(guān)，約2%～16%的胃癌組織中EBV陽(yáng)性，大多數(shù)罕見(jiàn)的淋巴上皮瘤樣胃癌和少部分常見(jiàn)的胃腺癌組織中均檢測(cè)到EBV基因組的存在，且可見(jiàn)于各種病理類(lèi)型的胃癌如高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌〔5～7〕。羅兵等〔8〕用含有EBV的Akata和P3HR-1 細(xì)胞毒株感染人胃癌印戒細(xì)胞系(HSG-39),結(jié)果表明,EBV感染的親代細(xì)胞及大部分克隆表達(dá)EBNA1，但不表達(dá)EBNA2、潛伏期膜蛋白LMP1和LMP2A；親代細(xì)胞及所有細(xì)胞克隆未觀察到裂解感染。同時(shí)觀察到：用P3HR-1毒株的EBV感染可促進(jìn)HSG-39細(xì)胞的生長(zhǎng)，而Akata毒株的EBV感染HSG-39細(xì)胞則幾次傳代后，細(xì)胞死亡。本研究結(jié)果顯示:用含有EBV的B95-8毒株分別感染BGC823、MKN45及MKN28細(xì)胞株后,可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng),并表達(dá)潛伏感染基因EBNA1、裂解早起基因BARF1及晚期基因BcLF1,表明EBV感染胃癌細(xì)胞既存在潛伏感染又存在裂解感染。結(jié)合羅兵等〔8〕結(jié)果可以看出：不同種的EBV毒株感染不同的胃癌細(xì)胞克隆，可能有不同的基因表達(dá)。

Truong等〔7〕研究的235例胃癌組織中，12例EBV陽(yáng)性胃癌組織中有4例為高分化腺癌和中分化腺癌，8例為低分化腺癌。因此認(rèn)為，EBV可能對(duì)中低分化胃腺癌較易感。并且感染的EBV幾乎表達(dá)在所有癌細(xì)胞中，表明EBV感染發(fā)生在胃癌形成的早期,感染EBV的腫瘤細(xì)胞單克隆增生,從而導(dǎo)致EBV陽(yáng)性表達(dá)在癌細(xì)胞組織。王云等〔9〕應(yīng)用RT-PCR和Southern雜交技術(shù)檢測(cè)185例胃癌組織，13例EBV陽(yáng)性胃癌組織中檢測(cè)到6例早期基因BARF1的表達(dá)，提示早期基因BARF1在EBV陽(yáng)性胃癌發(fā)生過(guò)程中可能起重要作用。

總之,用EBV感染不同分化程度的胃癌細(xì)胞系，為EB病毒相關(guān)胃癌的研究提供了EBV陽(yáng)性胃癌的細(xì)胞模型，為深入探討EB病毒相關(guān)胃癌發(fā)生的機(jī)制提供了前提支持。

4 參考文獻(xiàn)

1Iizasa H,Nanbo A,Nishikawa J,etal.Epstein-Barr Virus(EBV)-associated gastric carcinoma〔J〕.Viruses，2012；4(12):3420-39.

2Zhu S,Sun P,Zhang Y,etal.Expression of c-myc and PCNA in Epstein-Barr virus-associated gastric carcinoma〔J〕.Exp Ther Med，2013；5(4):1030-4.

3Marquitz AR,Mathur A,Shair KH,etal.Infection of Epstein-Barr virus in a gastric carcinoma cell line induces anchorage independence and global changes in gene expression〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2012；109(24):9593-8.

4Tang W,Morgan DR,Meyers MO,etal.Epstein-barr virus infected gastric adenocarcinoma expresses latent and lytic viral transcripts and has a distinct human gene expression profile〔J〕.Infect Agent Cancer，2012；28;7(1):7-21.

5Ryan JL,Morgan DR,Dominguez RL,etal.High levels of Epstein-Barr virus DNA in latently infected gastric adenocarcinoma〔J〕.Lab Invest,2009；89(1)：80-90.

6Kim do N,Seo MK,Choi H,etal.Characterization of naturally Epstein-Barr virus-infected gastric carcinoma cell line YCCEL1〔J〕.J Gen Virol， 2013；94(Pt 3):497-506.

7Truong CD,Feng W,Li W,etal.Characteristics of Epstein-Barr virus-associated gastric cancer：A study of 235 cases at a comprehensive cancer center in USA〔J〕.J Exp Clin Cancer Res,2009；28(1):1-9.

8羅 兵,村上雅尚,柳原五吉,等.EB病毒對(duì)人胃癌細(xì)胞系HSC-39 感染的研究〔J〕.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2002；22(4):379-84.

9王 云,羅 兵,王笑峰,等.胃癌組織中EB病毒的檢測(cè)及其增殖期基因的表達(dá)〔J〕.中國(guó)癌癥雜志,2004；14(3)：217-21.