齊亞靈 孟德欣 楊廣民 周曉紅 李艷君 楊 宇 譚 巖

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154002)

腫瘤的形成是由于各種致癌因素引起DNA損傷，從而激活原癌基因和(或)滅活抑癌基因；或者凋亡調(diào)控基因和(或)DNA修復(fù)基因發(fā)生改變，進(jìn)而引起基因表達(dá)異常?；蛞呙缡菍⒕幋a抗原的基因片段克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒，將該質(zhì)粒免疫動物，致使編碼抗原的基因片段在宿主體內(nèi)表達(dá)，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)殺傷腫瘤。本文觀察pcIL-18-MAGE-1共表達(dá)基因疫苗免疫后小鼠脾細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤特異性 CTL 對肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、Hepal-6的殺傷作用，探究pcIL-18-MAGE-1共表達(dá)基因疫苗抗腫瘤作用。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株、質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)動物 質(zhì)粒 pcDNA3、pcIL-18-pcMAGE-1、肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和Hepal-6為吉林省人民醫(yī)院腫瘤生物治療中心提供。清潔級雌性C57BL/6J小鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所)，體重(20±2)g，自由食水，無菌動物室飼養(yǎng)。

1.2主要試劑和儀器 胎牛血清、IMDM 細(xì)胞培養(yǎng)液、淋巴細(xì)胞分離液、MTT、DMSO、3%氫氧化鋁(武漢博士德公司)。FITC與PE標(biāo)記的羊抗鼠CD4+、CD8+單抗、FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG單抗(美國Immunotech公司)。流式細(xì)胞儀(FCM)(美國BD公司)、HF240二氧化碳培養(yǎng)箱(上海斯高勒生物科技有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及免疫方法 將30只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為3組各10只。疫苗免疫組肌注100 μg pcIL-18-pcMAGE-1(0.4 ml 3%氫氧化鋁膠)；空白對照組肌注等量生理鹽水；陰性對照組肌注等量空質(zhì)粒pcDNA3。注射部位：小鼠大腿內(nèi)側(cè)肌群。每隔10 d注射1次，共3次。末次注射7 d后，斷頭處死小鼠，將取出的脾臟浸入含 10%胎牛血清的IMDM細(xì)胞培養(yǎng)液中研磨，用200目濾網(wǎng)過濾，收集脾細(xì)胞懸液于玻璃試管中備用。

1.4小鼠T細(xì)胞亞群及自然殺傷(NK)細(xì)胞活性檢測 每組分別取1×106個(gè)小鼠脾細(xì)胞，0.1 mol/L PBS洗2次，分別加入單抗10 μl，室溫避光，20 min。PBS洗2次，加0.5 ml PBS混勻，10 min后，F(xiàn)CM檢測。

1.5小鼠脾細(xì)胞CTL活性測定 將SMMC-7721細(xì)胞及Hepal-6細(xì)胞分別加入到96孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，同時(shí)取陰性對照組及疫苗免疫組的1×106個(gè)效應(yīng)脾細(xì)胞分別加入到上述96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜；棄掉培養(yǎng)基，每孔加50 μl 0.5 mg/ml MTT，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，棄上清，每孔加100 μl DMSO，酶標(biāo)儀測570 nm處的吸光值(OD值)。殺傷率(%) = 〔1- (效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞)OD值-效應(yīng)細(xì)胞OD值/靶細(xì)胞OD值〕×100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞活性檢測結(jié)果 與兩個(gè)對照組比較，疫苗免疫組脾細(xì)胞中CD4、CD8 T細(xì)胞比例及CD4/CD8比值、NK細(xì)胞活性顯著增高(P<0.01，P<0.05)。陰性對照組與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。見表1。

2.2免疫小鼠脾細(xì)胞對肝癌SMMC-7721細(xì)胞及Hepal-6細(xì)胞殺傷率 共表達(dá)pcIL-18-pcMAGE-1基因疫苗對SMMC-7721細(xì)胞及Hepal-6細(xì)胞均具有顯著抑制性，與對照組比較，差異顯著，且對SMMC-7721細(xì)胞殺傷率明顯高于Hepal-6細(xì)胞(P<0.05)，見表2。

表1 各組CD4、 CD8、CD4/CD8及NK細(xì)胞值比較(n=10，±s,%)

表2 各組脾細(xì)胞對SMMC-7721和 Hepal-6細(xì)胞殺傷率(n=3，±s，%)

3 討 論

基因疫苗是近10年發(fā)展起來的新型疫苗，又叫核酸疫苗或DNA疫苗，目前基因疫苗的研究已涉及病毒、支原體、衣原體、寄生蟲、螺旋體、細(xì)菌以及癌癥等諸多領(lǐng)域，一些基因疫苗的研究已處于Ⅰ、Ⅱ期臨床研究階段?；蛞呙缗c常規(guī)的滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗及重組疫苗相比，具有安全、有效、制備容易、保存運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)。眾多學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MAGE-1基因、蛋白在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)〔1～4〕，并且MAGE-1是用T細(xì)胞毒方法鑒定的第一個(gè)人類腫瘤抗原〔5〕，MAGE被認(rèn)為是免疫原性最強(qiáng)的腫瘤抗原之一〔6〕，目前，MAGE-1的腫瘤疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，在一些腫瘤的治療中取得較好的療效〔6〕。

白細(xì)胞介素(IL)-18能夠增強(qiáng)NK 細(xì)胞的活性，促進(jìn) Th1、NK 細(xì)胞增殖。IL-18 可產(chǎn)生有效的免疫調(diào)節(jié)作用，是一種良好的免疫佐劑〔7，8〕，CD4 T為輔助性T細(xì)胞，CD8 T為殺傷性T細(xì)胞。由此可以推斷，pcIL-18-pcMAGE-1共表達(dá)基因疫苗通過提高CD4 T比值，對C57BL/6J小鼠MAGE-1抗體生成、巨噬細(xì)胞活化、NK細(xì)胞活化及CTL的活化有輔助、放大效應(yīng)，并通過它們發(fā)揮免疫作用；通過提高CD8 T比值，增加C57BL/6J小鼠NK細(xì)胞活性，促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞的殺傷功能。并且誘導(dǎo)腫瘤特異性 CTL直接殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，制備以 MAGE-1 抗原為靶點(diǎn)、以IL-18為佐劑pcIL-18-pcMAGE-1基因疫苗通過提高機(jī)體免疫功能，促進(jìn)NK細(xì)胞活性，誘導(dǎo)腫瘤特異性 CTL，產(chǎn)生廣譜抗腫瘤免疫效應(yīng)，避免了單一腫瘤疫苗只針對一種腫瘤的局限，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

4 參考文獻(xiàn)

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2劉 寧，梁 寒，李 強(qiáng),等.MAGE-1、MAGE-3及AFP基因在肝癌組織中的表達(dá)〔J〕. 中國腫瘤臨床，2007；34(9)：493-6.

3Yuasa T，Okamoto K，Kawakami T，etal. Expression patterns of cancer testis antigens in testicular germ cell tumors and adjacent testicular tissue〔J〕. J Urol，2001；165(5)：1790-4.

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7Hart G，F(xiàn)laishon L，Shachar I. IL-12 and IL-18 down-regulate B cell migration in an Ly49D-dependent manner〔J〕. Eur J Immu，2007；37(7)：1996-207.

8時(shí) 陽，楊廣民，李首慶,等.MAGE-1與IL-18共表達(dá)DNA疫苗的構(gòu)建與體外表達(dá)〔J〕. 中國老年學(xué)雜志，2007；27(19)：1865-8.