遲 強(qiáng) 王志勇 劉 英 彭偉彬 王澤民 宋殿賓 周逢海

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科,河北 承德 067000)

在心血管疾病的基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊參與了細(xì)胞間的興奮傳導(dǎo)〔1〕?？p隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊直接參與相鄰細(xì)胞間神經(jīng)信號的傳收縮方面發(fā)揮重要作用〔2～4〕。Haefliger等〔5,6〕通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)縫隙連接蛋白-43(Cx-43)是大鼠逼尿肌細(xì)胞中重要的連蛋白。在人類的逼尿肌細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)了Cx-43與Cx-45。在一項(xiàng)關(guān)于排尿功能障礙的研究中發(fā)現(xiàn)Cx-43在逼尿肌中的表達(dá)發(fā)生改變。Fry等〔7,8〕指出逼尿肌的興奮依賴于縫隙連接的存在。本實(shí)驗(yàn)探討膀胱出口部分梗阻(P-BOO)的大鼠逼尿肌細(xì)胞膜上縫隙連接和Cx-43表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1P-BOO動(dòng)物模型的建立 33只10周齡雌性Wistar大鼠，體重170～260 g，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供〔動(dòng)物合格證SCXK(京)2007-0009、SPF級〕。隨機(jī)分為兩組：模型組中造模后2 w處死6只；造模后4 w處死6只；造模后8 w處死6只。假手術(shù)組中2 w處死5只；4 w處死5只；8 w處死5只。上述各組大鼠處死后取膀胱逼尿肌組織進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。P-BOO動(dòng)物模型的建立參照Mattiasson等〔9，10〕的造模方法。大鼠通過腹腔注射25%烏拉坦(1 g/kg)麻醉后，用硬膜外導(dǎo)管(直徑1 mm)經(jīng)尿道插入膀胱，小心游離尿道,游離至近膀胱頸口處，4-0 PGLA醫(yī)用可吸收絲線結(jié)扎近膀胱頸口處尿道,結(jié)扎松緊度以線結(jié)剛靠近尿道為宜，拔出導(dǎo)管,縫合皮膚。假手術(shù)組操作同上，但不結(jié)扎尿道。

1.2排尿壓測定 將實(shí)驗(yàn)大鼠，25%烏拉坦(1 g/kg)腹腔注射麻醉〔11〕，仰臥固定，用硬膜外導(dǎo)管(直徑1 mm)經(jīng)尿道插入膀胱，硬膜外導(dǎo)管接經(jīng)三通管與尿動(dòng)力儀及微量泵(UDS-600,加拿大)相連。標(biāo)定零點(diǎn)，生理鹽水經(jīng)微量灌注泵向膀胱灌注，速度為 0.2 ml/min〔12〕，同步記錄隨容積增加膀胱壓力波形、大小變化，至尿道口周圍溢水定義為膀胱最大容量(灌注速度×灌注時(shí)間=膀胱最大容量)并記錄膀胱殘余尿量。

1.3免疫組織化學(xué)檢測 所有膀胱逼尿肌樣本均用4%的多聚甲醛浸泡固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片。隨后加入一抗兔抗大鼠的Cx-43多克隆抗體(1∶100武漢博士德生物工程有限公司)，過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶100武漢博士德生物工程有限公司)。對照組中用0.01 mmol/L PBS (武漢博士德生物工程有限公司)代替一抗作陰性對照。

1.4冰凍蝕刻分析 樣本加戊二醛固定，隨后加入30%的甘油緩沖液，置入液氮中冷凍。樣本在-112℃的冷凍斷裂機(jī)(JFD-7000 日本)中被反復(fù)破碎斷裂。樣本在次氯酸鈉溶液中被消化，隨后加入濃度為1∶1的甲基氯仿對丙烯基苯酚和100%二甲基甲酰胺。將復(fù)合物置于網(wǎng)格中在透射電子顯微鏡(JEM-1210 日本)下觀察。

1.5Western 印跡檢測 膀胱逼尿肌組織被剔除黏膜層后加入1 mmol/L碳酸氫鈉(NaHCO3)溶液和2 mmol/L苯基甲磺酰氟化物蛋白酶抑制劑的混合片劑(Roche 美國)，同時(shí)經(jīng)高頻聲波處理。Western 印跡和SDS-PAGE 電泳(每個(gè)泳道上樣40 μg)。為了檢測Cx-43的含量，先后加入兔抗大鼠的Cx-43多克隆抗體和用過氧化物酶標(biāo)記的熒光二抗。檢測結(jié)果采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，X光片曝光顯影，凝膠圖像處理系統(tǒng)(EPA-3000 日本)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 組間數(shù)據(jù)的差異性比較行Mann-Whitney U test檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1膀胱重量及容量 模型組大鼠的膀胱重量較假手術(shù)組大鼠顯著增加(P<0.01)。在術(shù)后4 w和8 w模型組大鼠的膀胱容積較術(shù)后2 w顯著增加(P<0.05)。見表1。

2.2膀胱測壓結(jié)果 在假手術(shù)組中大鼠的排尿模式正常。在術(shù)后2 w模型組大鼠的排尿壓較假手術(shù)組顯著增加。然而，模型組中術(shù)后4 w大鼠的排尿壓較術(shù)后2 w顯著降低。在模型組中術(shù)后8 w大鼠的逼尿肌沒有發(fā)生收縮，同時(shí)出現(xiàn)尿失禁現(xiàn)象(圖1)。

表1 兩組膀胱重量及容積比較±s)

圖1 兩組大鼠膀胱測壓結(jié)果比較

2.3大鼠逼尿肌細(xì)胞膜中Cx-43的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 術(shù)后2 w模型組大鼠的逼尿肌細(xì)胞膜、胞質(zhì)、胞核中均有Cx-43表達(dá)。術(shù)后4 w模型組大鼠逼尿肌細(xì)胞的胞質(zhì)、胞核和胞膜上均有部分CX-43表達(dá)。然而，術(shù)后8 w模型組大鼠逼尿肌細(xì)胞中Cx-43主要被檢測到在胞質(zhì)或胞核中，胞膜未見其表達(dá)。假手術(shù)組大鼠的逼尿肌細(xì)胞中Cx-43的表達(dá)未見異常。模型組中隨著術(shù)后時(shí)間的延長，Cx-43的表達(dá)也隨之降低：2 w 100%；4 w 76.4%±2.3%；8 w 4.3%±1.6%。見圖2。

2.4縫隙連接的形態(tài)學(xué)分析 每個(gè)縫隙連接像凝聚的圓形顆粒圖3。在假手術(shù)組大鼠逼尿肌中存在許多縫隙連接，并且每個(gè)網(wǎng)格中縫隙連接的數(shù)量分別為：術(shù)后2 w 3.2±0.12；術(shù)后4 w 2.1±0.77；術(shù)后8 w 3.0±0.57。模型組大鼠逼尿肌中縫隙連接的數(shù)量在對應(yīng)時(shí)間內(nèi)較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)，分別為：術(shù)后2 w 1.7±0.42；術(shù)后4 w 1.1±0.55；術(shù)后8 w沒有檢測到縫隙連接的存在?？p隙連接的形態(tài)在兩組中沒有差異(P>0.05)。見圖3。

A假手術(shù)組；B假手術(shù)組術(shù)后8 w；C陰性對照組；D模型組術(shù)后2 w；E模型組術(shù)后4 w；F模型組術(shù)后8 w

假手術(shù)組 模型組

2.5Western 印跡檢測與SDS-PAG電泳結(jié)果 假手術(shù)組中Cx-43在術(shù)后2、4、8 w中的表達(dá)分別為(4.13±0.71)、(4.25±0.5)、(4.64±0.82)。模型組中Cx-432、4、8 w中的表達(dá)分別為(8.09±0.43)、(8.37±0.36)、(11.27±0.69)，較假手術(shù)組顯著增高(P<0.05)。在模型組中Cx-43的表達(dá)隨時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng)。見圖4。

圖4 Cx-43的免疫蛋白印記分析

3 討 論

P-BOO常繼發(fā)于慢性前列腺增生，一般認(rèn)為膀胱逼尿肌細(xì)胞的增生、肥大是該病的病理學(xué)基礎(chǔ)。這些組織學(xué)的改變伴隨相應(yīng)的功能改變，包括殘余尿量增多，尿頻及排尿壓的改變?？p隙連接是通過位于相鄰細(xì)胞膜之間的連接子構(gòu)成，其化學(xué)成分為六聚體的連接蛋白。目前發(fā)現(xiàn)在人體中至少有13種縫隙連接蛋白基因?？p隙連接蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊可能在調(diào)控胚胎的發(fā)育，細(xì)胞的生長、分化等方面發(fā)揮重要作用?？p隙連接是人體及動(dòng)物細(xì)胞膜上的特殊結(jié)構(gòu)，構(gòu)成了相鄰細(xì)胞間的特殊通道，信息離子(包括鈣離子)及小分子可通過此通道進(jìn)入細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)許多重要的生理功能。

通過縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞間的信息通訊對排尿功能調(diào)節(jié)有密切關(guān)系。術(shù)后2 wCx-43在兩組大鼠逼尿肌細(xì)胞膜上均有表達(dá)，說明逼尿肌的收縮是通過縫隙連接介導(dǎo)的。結(jié)果提示細(xì)胞膜上Cx-43表達(dá)降低導(dǎo)致了縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊障礙。通過電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠逼尿肌中隨著梗阻時(shí)間的延長縫隙連接數(shù)量逐漸減少。因此，Cx-43在細(xì)胞膜上表達(dá)的降低與逼尿肌的收縮和梗阻時(shí)間呈平行關(guān)系。

Christ等〔13〕報(bào)道在膀胱過度活動(dòng)癥的大鼠逼尿肌中Cx-43 mRNA和蛋白表達(dá)是顯著增加的。在本研究中發(fā)現(xiàn)Cx-43在模型組中的表達(dá)較假手術(shù)組顯著增強(qiáng)，并且通過制造P-BOO導(dǎo)致Cx-43在逼尿肌中的表達(dá)上調(diào)。Cx-43的表達(dá)上調(diào)與Cx-43在胞膜中的表達(dá)下降可能是由于P-BOO所致逼尿肌細(xì)胞過分拉伸。

國外報(bào)道Cx-43參與膀胱壁收縮來增加排尿壓。然而，逼尿肌的收縮和Cx-43的定位沒有明確〔14〕。Cx-43的表達(dá)位置在研究縫隙連接耦聯(lián)功能上發(fā)揮重要作用〔15～17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在P-BOO的大鼠逼尿肌細(xì)胞膜上Cx-43的表達(dá)是降低的。因此，當(dāng)Cx-43不能表達(dá)在逼尿肌細(xì)胞膜上時(shí)膀胱逼尿肌細(xì)胞是不能發(fā)生同步收縮的。

在膀胱逼尿肌中縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊的功能障礙，究其原因是因?yàn)镃x-43在逼尿肌細(xì)胞膜上的表達(dá)降低所致。因此，正常的電信號不能在逼尿肌細(xì)胞中傳遞，致使排尿功能障礙。所以，縫隙連接的改變可能是導(dǎo)致排尿功能障礙性疾病發(fā)生的原因之一。

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