張寶輝 方秀斌 劉曉湘

(中國醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001)

支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種細(xì)胞因子在氣道炎癥發(fā)展過程中起重要作用。驅(qū)動(dòng)蛋白(Kinesin)-1在膜性細(xì)胞器的運(yùn)輸、有絲分裂、減數(shù)分裂、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、微管多聚體的動(dòng)力學(xué)控制、mRNA和蛋白質(zhì)的運(yùn)輸?shù)确矫嫫鹬匾饔谩?〕，人類的多種疾病都表現(xiàn)出了驅(qū)動(dòng)蛋白表達(dá)異常。研究發(fā)現(xiàn)，在人體內(nèi)，驅(qū)動(dòng)結(jié)合蛋白基因的5’端融合到ret基因表達(dá)酪氨酸激酶的區(qū)域，能夠?qū)е录谞钕偌?xì)胞癌變〔2〕；有研究報(bào)道，驅(qū)動(dòng)結(jié)合蛋白是白塞病(BD)的相關(guān)抗原，因此抗驅(qū)動(dòng)結(jié)合蛋白抗體與BD發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，值得深入探索〔3〕。Fridolfsson等〔4〕研究表明驅(qū)動(dòng)結(jié)合蛋白可能是再生障礙性貧血病人的自身抗原之一。但是，Kinesin-1在哮喘小鼠C7～T5節(jié)段脊髓后角內(nèi)的表達(dá)是否發(fā)生變化尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬探討采用免疫熒光和Western印跡方法檢測各組小鼠C7～T5節(jié)段脊髓后角內(nèi)kinesin-1的表達(dá)變化。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備 雌性BALB/c小鼠20只，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按隨機(jī)數(shù)字表法分為:(1)哮喘組10只，第1天每只小鼠腹腔注射20 μg卵蛋白(OVA)(Sigma公司)和2 mg氫氧化鋁混合于0.5 ml PBS中，第8天、15天每只小鼠腹腔注射10 μg OVA和1 mg氫氧化鋁混合于0.5 ml PBS中，第16天開始將小鼠置于封閉容器中，給予4% OVA(PBS配成)霧化吸入激發(fā)哮喘發(fā)作，每天1次，25 min/次，連續(xù)7 d。 (2)正常對(duì)照組，以PBS代替OVA注射和霧化吸入，其余均與哮喘組相同。各組最后一次激發(fā)后24 h處死。

1.2AniRes2005肺功能儀測氣道反應(yīng)性 用0.4%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠(80 mg/kg)，疼痛反射消失后固定在小鼠體描箱內(nèi)操作臺(tái)上，氣管插管，呼吸比15∶10，呼吸頻率90次/min，游離頸外靜脈，行靜脈穿刺，固定針柄，封閉體描箱。乙酰甲膽堿(mAch)用磷酸緩沖液(0.1 mol/L pH 7.4)配成0.025、0.05、0.075、0.1 mg/kg經(jīng)頸外靜脈各注射0.1 ml，記錄波形和數(shù)據(jù)。

1.3免疫熒光 動(dòng)物用0.4%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg體重)，用4%多聚甲醛灌流固定，將組織后固定24 h，移入30%蔗糖緩沖液中致標(biāo)本下沉，OCT包埋，恒冷箱切片機(jī)連續(xù)切片(片厚8 μm)。冷風(fēng)干燥后，室溫下血清封閉20 min，甩干，滴加一抗-1(購自Santa Cruz公司)工作濃度為1∶150，4 ℃孵育過夜；PBS充分洗滌，滴加工作濃度為1∶100 FITC標(biāo)記的二抗(購自Sant Crutz公司)，孵育40 min；PBS充分洗滌，甘油封片，用OlympusBX51型熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。綠色熒光為陽性表達(dá)。

1.4Western免疫蛋白印跡 動(dòng)物用0.4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg)，取C7～T5節(jié)段脊神經(jīng)，置于裂解液中機(jī)械勻漿，4 ℃ 17 000 r/min離心1 h，吸出上清液，棄去沉淀。用考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合法，根據(jù)已知牛血清白蛋白溶液的濃度及其吸光度和樣品吸光度計(jì)算出樣品蛋白濃度和加樣量。加入樣品緩沖液，然后將樣品置于沸水浴中加熱5 min使蛋白質(zhì)變性。將制備好的樣品置于-20 ℃冰箱備用。制備12%分離膠，4%濃縮膠，用微量加樣器將樣品加在凝膠表面樣品槽中。電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉TTBS緩沖液4 ℃過夜。一抗Kinesin-1及β-actin(1∶200)室溫孵育2 h，洗膜，辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000,Santa Cruz)室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL試劑(Santa Cruz)反應(yīng)1 min，暗室曝光顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)上攝像分析，測得目標(biāo)帶的MOD，進(jìn)而計(jì)算出各組樣品目標(biāo)帶的MOD與內(nèi)參照β-actin MOD的比值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1哮喘模型制作結(jié)果 正常對(duì)照組霧化吸入生理鹽水后無明顯哮喘反應(yīng)，哮喘組動(dòng)物在霧化吸入OVA 3次后，大部分哮喘發(fā)作，表現(xiàn)為呼吸頻率加深加快，肋間隙凹陷，刺激性嗆咳，表明模型制作成功。

2.2AniRes2005肺功能儀測氣道阻力 哮喘組小鼠對(duì)mAch的濃度反應(yīng)曲線明顯上移，其呼氣阻力(ER)和吸氣阻力(IR)顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，表明哮喘小鼠對(duì)mAch的氣道反應(yīng)性顯著高于正常小鼠，哮喘模型建立成功(圖1)。

2.3免疫熒光結(jié)果 從哮喘組小鼠C7～T5節(jié)段脊髓的免疫熒光圖片上可以看到較強(qiáng)的Kinesin-1的熒光表達(dá)，而正常組小鼠C7～T5節(jié)段脊髓的免疫熒光表達(dá)較弱(圖2)，說明Kinesin-1的陽性表達(dá)較少;圖像分析結(jié)果表明，哮喘組小鼠Kinesin-1蛋白的熒光表達(dá)平均光密度值為(28.22±2.95),正常組小鼠為(16.11±2.03),二者平均光密度值差異顯著(P<0.01)。

圖1 AinRes 2005 肺功能儀測氣道阻力

圖2 免疫熒光檢測C7-T5節(jié)段脊髓組織KLC-1表達(dá)

2.4Western印跡結(jié)果 對(duì)Western印跡結(jié)果進(jìn)行分析光密度值分析，哮喘組小鼠Kinesin-1蛋白表達(dá)的MOD值與內(nèi)參照β-actin的MOD比值為(0.32±0.01),正常對(duì)照組小鼠Kinesin-1蛋白表達(dá)的MOD值與內(nèi)參照β-actin的MOD比值為(0.17±0.01),二者相比，平均光密度值差異顯著(P<0.01)。見圖3。

3 討 論

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的反復(fù)發(fā)作的可逆性的氣流受限和氣道高反應(yīng)性為特征的氣道慢性非特異性炎癥性疾病，我國哮喘發(fā)病率為1%，其中兒童達(dá)3%。近年來支氣管哮喘與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的研究一直受到國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)哮喘發(fā)生不僅僅與免疫炎癥相關(guān),同時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)也參與了哮喘的發(fā)病。但對(duì)于他們之間的相互作用及其機(jī)制尚不完全清楚。

驅(qū)動(dòng)蛋白是一種典型的分子馬達(dá)，由頭部、頸部和尾部區(qū)域組成，在細(xì)胞內(nèi)以微管為軌道運(yùn)動(dòng)。驅(qū)動(dòng)蛋白的頭部由兩條相同的鏈組成，每條重鏈的一端由約340個(gè)氨基酸折疊成球狀,它是馬達(dá)與微管蛋白結(jié)合和催化ATP水解的部位。其余部分相互盤繞成雙股的α螺旋。鏈的末端結(jié)合的輕鏈，稱為驅(qū)動(dòng)蛋白的尾部,用來連接要運(yùn)送的細(xì)胞器，頸部有兩個(gè),它們連接在馬達(dá)域上,并且可以伸屈〔5，6〕。近年研究發(fā)現(xiàn)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)離不開細(xì)胞骨架的參與,細(xì)胞骨架為囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)提供了軌道，而位于細(xì)胞骨架表面的驅(qū)動(dòng)結(jié)合蛋白，與囊泡存在相互作用，驅(qū)動(dòng)蛋白能夠催化水解ATP為二磷酸腺苷(ADP)和無機(jī)磷酸(Pi)，將貯藏在分子中的化學(xué)能高效地轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，產(chǎn)生定向運(yùn)動(dòng)，介導(dǎo)囊泡沿微管向正極的運(yùn)動(dòng)〔7，8〕。囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞從胞外獲得營養(yǎng)物質(zhì),以及胞內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn),可將營養(yǎng)物質(zhì)輸送到細(xì)胞各處,并確保功能蛋白準(zhǔn)確發(fā)揮效用，其功能紊亂會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。而在神經(jīng)元中，軸突末端到細(xì)胞體的距離很長,并且軸突末梢要釋放大量的神經(jīng)遞質(zhì),所以神經(jīng)元必須不斷合成、供給大量的物質(zhì),包括蛋白質(zhì)、膜,以補(bǔ)充因軸突部位的胞吐而喪失的成分。由于核糖體只存在于細(xì)胞體和樹突中,所以蛋白質(zhì)必須在細(xì)胞體中合成，然后通過順向轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)移到軸突。軸突的物質(zhì)也可通過逆向轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)移到胞體，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)循環(huán)，一旦這一循環(huán)遭到破壞，就會(huì)引發(fā)嚴(yán)重疾病。研究發(fā)現(xiàn)，tau纖維絲可以選擇性抑制驅(qū)動(dòng)蛋白介導(dǎo)的順向快速軸突轉(zhuǎn)運(yùn)(FAT),并引起驅(qū)動(dòng)蛋白與囊泡的解離,使軸突運(yùn)輸發(fā)生了障礙,重要物質(zhì)無法運(yùn)輸?shù)捷S突末梢，影響軸突末梢與胞體的交流,致使突觸功能失調(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡〔9〕。但是，在哮喘發(fā)病機(jī)制中，驅(qū)動(dòng)蛋白是否出現(xiàn)功能異常尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

4 參考文獻(xiàn)

1Vale RD，Milligan RA.The way things move：looking under the hood of molecular motor proteins〔J〕.Science,2000;288(5463)：88-95.

2Cho K,Yi H,Desai R,etal.RANBP2 is an allosteric activator of the conventional kinesin-1 motor protein,KIF5 B,in a minimal cell-free system〔J〕.EMBO J,2009;10(5):480-6.

3Wong YL,Dietrich KA,Naber N,etal.The kinesin-1 tail conformationally restricts the nucleotide pocket〔J〕.Biophys J,2009;96:2799-807.

4Fridolfsson HN,Ly N,Meyerzon M,etal.UNC-83 coordinates kinesin-1 and dynein activities at the nuclear envelope during nuclear migration〔J〕.Dev Biol,2010;338(2):237-50.

5DeBoer SR,You YM,Szodorai A,etal.Conventional kinesin holoenzymes are composed of heavy and light chain homodimers〔J〕.Biochemistry,2008;47(15):4535-43.

6Dietrich KA,Sindelar CV,Brewer PD,etal.The kinesin-1 motor protein is regulated by a direct interaction of its head and tail〔J〕.PNAS,2008;(105)26:8938-43.

7Araki Y,Kawano T,Taru1 H,etal.The novel cargo Alcadein induces vesicle association of kinesin-1 motor components and activates axonal transport〔J〕.EMBO J,2007;26:1475-86.

8Fridolfsson HN,Starr DA.Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei〔J〕.J Cell Biol,2010;191(1):115-28.

9LaPointe NE,Morfini G,Piqino G,etal.The amino terminus of tau inhibits kinesin-dependent axonal transport :implications for filament toxicity〔J〕.J Neurosci Res,2009;87:440-51.