楊青巖 楊發(fā)滿 李 軍 李曉平 汪遠(yuǎn)浚 張培莉 高 慧

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院老年科，青海 西寧 810001)

結(jié)核病是一種復(fù)雜疾病，研究表明，遺傳因素決定結(jié)核發(fā)病的可能性〔1〕。17q 11.2染色體區(qū)域與結(jié)核病易感性連鎖〔2〕，此區(qū)域編碼包括單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)及幾種趨化因子在結(jié)核病的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。MCP-1基因啟動(dòng)因子區(qū)-2518位點(diǎn)G/A多態(tài)性具有重要的生物學(xué)意義〔3〕。國(guó)內(nèi)未見(jiàn)在藏族結(jié)核人群中與MCP-1基因-2518位點(diǎn)G/A的GG基因型相關(guān)研究，本文擬揭示發(fā)病機(jī)制，為特異性診斷、生物治療和疫苗研制提供新的靶點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 以西寧市的結(jié)核病防治結(jié)構(gòu)為單位，收集結(jié)核病醫(yī)院、青大附院呼吸科、老年病科及玉樹(shù)州、果洛州等地區(qū)疾控中心2011年7月至2012年8月新發(fā)肺結(jié)核病例60例，年齡16～72歲，中位年齡42歲，其中男44例，女16例，均為初治患者，藏族。肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)〔4〕，排除其他傳染病及慢性病(如支氣管哮喘、肺炎、肝腎疾病、糖尿病、腫瘤、遺傳性過(guò)敏性疾病等)患者，排除器官移植、獲得性免疫缺陷病毒(HIV)感染及長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素者，選取同時(shí)期在青大附院體檢中心體檢患者60例為對(duì)照，年齡17～72歲，中位年齡42歲，男44例，女16例，均排除肺結(jié)核病史，其他排除標(biāo)準(zhǔn)同病例組，均為藏族，以年齡差≤3歲和性別與病例組進(jìn)行1∶1匹配。

1.2調(diào)查內(nèi)容及方法 由進(jìn)行過(guò)培訓(xùn)的我科醫(yī)師，應(yīng)用設(shè)計(jì)的調(diào)查表調(diào)查研究對(duì)象的年齡、性別、民族、婚姻、職業(yè)、文化程度、體重指數(shù)、卡介苗接種史、結(jié)核患者密切接觸史(直接接觸親屬、同事和同學(xué)中有患結(jié)核病者)、吸煙史、飲酒和健身活動(dòng)、工作環(huán)境化學(xué)煙霧和粉塵暴露情況、接受衛(wèi)生宣傳教育情況。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.3主要試劑與儀器 (1) 試劑包括 DNA zol BD Reagent,platinum TaqDNA聚合酶(Invitrogen);異丙醇，75%乙醇(廣州化學(xué)試劑廠);PvuⅡn內(nèi)切酶(NEB)；西班牙電泳瓊脂糖(BIOWEST),引物均有Invitrogen公司合成。(2)儀器 PCR儀，電泳儀 (Bio-Red),高速離心機(jī)，移液器，制冰機(jī)(北京長(zhǎng)流)漩渦振蕩器(江蘇其林貝爾)。

1.4實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1DNA提取 (1)0.5 ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，加入1 ml DNAzolBP試劑漩渦振蕩。(2)加入0.4 ml異丙醇漩渦振蕩，室溫放置5 min,6 000 r/min離心6 min,去上清；(3)加入0.5 ml DNAzolBD試劑，漩渦震蕩至沉淀全部溶解，6 000 r/min離心5 min,去上清。(4)加入1 ml 75%乙醇，吹吸數(shù)次混勻沉淀。6 000 r/min離心5 min,去上清，重復(fù)一遍。(5)空氣干燥5～10 min,加入0.1 ml ddH2O充分溶解。

1.4.2PCR引物 (1)引物: Manocyte chemoattractant protein,MCP-1;正義:5'-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3';長(zhǎng)義：5'-GTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3';長(zhǎng)度：929 bp;(2)PCR反應(yīng)體系: 10×PCR緩沖液5 μl; d NTP Mixture (10 mmol/L)1 μl; MgCl2(50 mmol/L)1.5 μl;正義：10 μmol/L 1 μl;反義：10 μmol/L 1 μl;PlatinumR Tag DNA多聚酶0.2 μl;DNA 2 μl;H2O38.3 μl;總共50 μl；(3)PCR 條件 94℃ 2 min; 94℃ 30 s,63℃ 30 s 72℃ 5 min。

1.4.3PCR產(chǎn)物電泳 配置1.5%瓊脂糖凝膠，取5 μl PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)。

1.4.4酶切 ①酶切體系：NE緩沖液4 2 μl，Puv Ⅱ0.5 μl，PCR產(chǎn)物 500 ng(5～10 μl)，H2O Xμl，總共20 μl 。②酶切條件：37℃ 150 min,80℃ 20 min。

1.4.5電泳 配置2%瓊脂糖凝膠，取5 μl 酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。

1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果 酶切產(chǎn)物電泳顯示單一929 bp條帶，待檢樣本MCP-1-2518為A/A型；酶切產(chǎn)物電泳顯示223 bp和706 bp兩條條帶，待檢樣本MCP-1-2518為G/G型；酶切產(chǎn)物電泳顯示929 bp，223 bp和706 bp三條條帶則待檢樣本MCP-1-2518為A/G型。見(jiàn)圖1，圖2。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、單因素分析和多因素分析。

2 結(jié) 果

2.1遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果 AA、GA和GG基因型在病例組的分布頻率分別為分別為12/60(20%)、30/60(50%)和18/60(30%) ,在對(duì)照組的分布頻率分別為6/60(10%)、12/60(20%)和42/60(70%)(χ2=3.24，P>0.05)。

2.2單因素分析結(jié)果 環(huán)境因素中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素有文化程度、卡介苗接種史、結(jié)核患者密切接觸史、體重指數(shù)、心理健康程度、蛋白質(zhì)及蔬菜攝入、吸煙史、室內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生、工作環(huán)境粉塵暴露、勞動(dòng)強(qiáng)度；兩組基因型頻率的差異顯著(χ2=24.041，P<0.01)

2.3多因素分析結(jié)果 介苗接種史、吸煙史、心理健康、臥室人數(shù)、居住環(huán)境采光情況、工作環(huán)境粉塵暴露和家庭人均月收入與-2518MCP-1基因型的表達(dá)相關(guān)。見(jiàn)表1。

圖1 患者組MPC-1-2518實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 對(duì)照組MCPT1-2518實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1-2518MCP-1基因型與藏族肺結(jié)核發(fā)病的多因素回歸分析結(jié)果

自變量β值標(biāo)準(zhǔn)誤 χ2值P值OR值95%CI卡介苗接種史0.6660.19311.891<0.011.9471.333～2.843吸煙史0.5540.1789.688<0.011.740 1.228～2.466心理健康0.1730.1052.737>0.051.1890.969～1.460臥室人數(shù)0.3290.10410.079<0.011.3901.130～1.703居室環(huán)境采光情況0.2140.1223.079>0.051.2390.975～1.574工作環(huán)境粉塵暴露0.1820.0963.637>0.051.2000.995～1.448家庭人均月收入-0.3230.1733.497>0.050.7240.516～1.016基因型 AA--7.3670.025-- GA0.6870.2786.1240.0131.9891.154～3.428 GG0.2280.2680.7240.3951.2570.742～2.127

3 討 論

目前，篩選易感基因最常用方法為候選基因法〔5〕， MCP-1對(duì)單核巨噬細(xì)胞具有明顯的趨化作用，它是趨化因子CC的亞族成員，可趨化單核、巨噬細(xì)胞到炎癥反應(yīng)部位，可由單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等分泌。Rovin等〔6〕發(fā)現(xiàn)，MCP-1基因2518位點(diǎn)G/A多肽性影響基因轉(zhuǎn)錄活性，從AG或GG基因型個(gè)體分離出的細(xì)胞，較AA個(gè)體產(chǎn)生更多的MCP-1,從而可以證實(shí)在MCP-1基因啟動(dòng)子區(qū)-2518位點(diǎn)為G的個(gè)體，相同條件下，較AA個(gè)體能產(chǎn)生更多的MCP-1,引起更強(qiáng)大炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)果與漢族人群及墨西哥和韓國(guó)人人群研究不同〔7〕，如果其 MCP-1 基因中的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)攜帶AG和GG基因型將比攜帶純和的AA基因型的人發(fā)生活動(dòng)性結(jié)核的概率高出 2.3 ～ 5.4 倍；而在韓國(guó)受試者中概率高6.9 倍。在亞洲人亞組實(shí)驗(yàn)中，等位基因A與結(jié)核病易感性有相關(guān)性。由于MCP-1能趨化免疫細(xì)胞至感染病灶，因此在結(jié)核菌感染早期免疫應(yīng)答中MCP-1扮演著重要角色。但是，高水平MCP-1蛋白質(zhì)能抑制免疫應(yīng)答相關(guān)蛋白質(zhì)白介素(IL)-12的產(chǎn)生，如IL-12表達(dá)過(guò)低，感染灶免疫細(xì)胞不能有效活化，致使機(jī)體易遭受病菌入侵。攜純和的 GG 基因型的受試者，血漿中MCP-1 蛋白質(zhì)量最高，而 IL-12 p40蛋白質(zhì)含量最低；更容易感染肺結(jié)核。造成本研究結(jié)果原因可能有以下幾點(diǎn)：(1)MCP-1在疾病中的雙重作用，就MCP-1生物學(xué)功能基因定位和調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及受體的特性及與基因細(xì)胞因子和炎性細(xì)胞等協(xié)同作用研究將為肺結(jié)核的病因病學(xué)提供更多的資料,MCP-1的調(diào)節(jié)比較復(fù)雜，具有組織的特異性,有關(guān)單核細(xì)胞趨化性調(diào)節(jié)的研究進(jìn)一步研究以細(xì)胞因子與種族異質(zhì)性有關(guān),因此需進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)MCP-1基因多態(tài)性、MCP-1濃度及大樣本研究；(2) MCP-1 基因可能與其他基因連鎖不平衡或相互抵消其對(duì)結(jié)核病易感性的影響，人類(lèi)白蛋白抗原與腫瘤壞死因子(TNF)-α相關(guān)，而TNF-α與IL-10平衡對(duì)控制和傳播肺結(jié)核起著重要的作用〔8〕；(3)結(jié)核病易感性既有遺傳因素的影響，也受環(huán)境因素的影響，以往研究結(jié)果表明，卡介苗接種史或結(jié)核病暴露史與TNF-α-238的基因型存在相互作用〔8〕；(4)基因與基因或基因與環(huán)境因素之間的相互作用尚有待進(jìn)行深入研究。

4 參考文獻(xiàn)

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