易傳安 汪 冶 胡祥上 于鵬輝 王 濱

(中南大學湘雅醫(yī)學院，湖南 長沙 410000)

血管性癡呆(VD) 是由一系列腦血管因素導致腦組織損害引起的以認知功能下降為特征的癡呆綜合征。有些關鍵部位的梗死(如海馬、丘腦等)，最小梗死容量只要達到1～30 ml就可能發(fā)生癡呆〔1，2〕。文獻〔3〕報道丘腦多次發(fā)病和雙側(cè)丘腦同時發(fā)病較易引起癡呆，而且丘腦內(nèi)側(cè)部損傷導致的認知功能障礙比丘腦其他部位尤為嚴重。

何首烏具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)、強筋骨、化濁降脂等作用，主要用于血虛萎黃、眩暈耳鳴、須發(fā)早白、腰膝酸軟、肢體麻木、崩漏帶下、高脂血癥的治療。目前研究〔4，5〕表明，何首烏主要含有蒽醌、二苯乙烯苷、卵磷脂等成分，可增加衰老大鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)如5-羥色胺(5-HT)、多巴胺的含量，增強超氧化物歧化酶活性，消除自由基對機體的損傷，對VD具有減緩癥狀、延緩衰老、神經(jīng)保護等作用，但具體作用機制尚未完全闡明。5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種經(jīng)典的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，與5-HT受體結(jié)合后可調(diào)控多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，參與學習記憶功能〔6〕。本課題采用何首烏提取物治療VD大鼠，觀察丘腦前核(ATN)內(nèi)5-HT受體的表達水平以及超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)的含量變化，進一步探討VD大鼠在形成過程中的發(fā)病機制以及何首烏對其的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SD雄性大鼠32只，體重250～350 g，由安徽省實驗動物中心提供(本實驗主要在安徽醫(yī)科大學藥理學教研室完成)，合格證號：SCXK(皖)：2005-001。 將大鼠隨機分成4組，每組8只，即假手術(shù)組、模型組、陽性對照組(石杉堿)和何首烏組。

1.1.2藥品與試劑 何首烏提取物來自懷化醫(yī)學高等?？茖W校中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中心。SOD、MDA測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3實驗儀器 Morris水迷宮，中國醫(yī)學科學院藥物研究所產(chǎn)品；SpectraMax 190型全波長酶標儀，美國MD公司。 LG10-2.4A型超速離心機，北京醫(yī)用離心機廠產(chǎn)品；熒光顯微鏡，日本尼康公司；-80℃超低溫冰箱，日本三洋電子有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1何首烏的提取 取熟何首烏800 g，用70%乙醇回流提取2次。在堿性環(huán)境中真空濃縮干燥制成浸膏。何首烏組每月按1 g/kg灌胃1次，共60 d。

1.2.2大鼠VD模型的建立 采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法制作大鼠VD模型。大鼠10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，頸部正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，0號線結(jié)扎其遠近心端，并從中間剪斷，慶大霉素消毒，縫合切口，放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不結(jié)扎和不剪斷頸總動脈外，其余過程與VD組相同。各組大鼠于造模后第2天開始給藥，用藥組給予相應藥物，假手術(shù)組和模型組予等容量蒸餾水60 d。

1.2.3大鼠Morris水迷宮實驗 水迷宮為一圓形不銹鋼箱，直徑160 cm、高50 cm，按方位設東南西北4個不同象限，安全平臺設于第Ⅱ象限正中，水面高于臺面2 cm，水溫控制在25℃左右。水池上方有一攝像機與計算機連接。造模后60 d測定大鼠的學習和記憶功能。實驗共歷時4 d，前4 d為訓練時間，實驗數(shù)據(jù)為學習成績，第4天訓練結(jié)束后撤去平臺，進行空間探索實驗(90 s)，記錄大鼠平臺象限游泳時間和穿越平臺次數(shù)，實驗數(shù)據(jù)記為記憶成績。大鼠每天訓練4次，每次訓練間隔4 min，每次分別從4個不同的標記點將大鼠于象限邊緣1/2弧度處頭朝池壁入水，同時用攝像機開始記錄大鼠找到站臺的時間，即逃避潛伏期。如大鼠在90 s內(nèi)未找到站臺，由實驗者引導大鼠找到平臺，潛伏期記為90 s。數(shù)據(jù)采集及圖像分析均由圖像自動監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。

1.2.4生化指標檢測 各組大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，股動脈取血，血漿離心取上清液。根據(jù)試劑盒說明書操作，檢測血清SOD活性和MDA含量。

1.2.5免疫組化檢測5-HT2A受體表達 大鼠腦組織石蠟切片用二甲苯和梯度酒精脫蠟至水后，置于蘇木精染液染色5 min，蒸餾水沖洗；PBS浸泡切片5 min；3%過氧化氫室溫孵育5 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3次，2 min/次；在切片上滴加10%正常山羊血清(PBS緩沖液稀釋)，放置在濕盒中，室溫孵育10～15 min，封閉游離的結(jié)合位點，減少非特異性染色；甩去多余山羊血清，勿洗，滴加一抗(抗TNF-α，用0.01 mol/L PBS緩沖液稀釋成1∶1 000)，4℃孵育過夜；PBS漂洗3次，2 min/次；滴加生物素標記的二抗(羊抗兔IgG工作液)，37℃孵育30 min；PBS漂洗3次，2 min/次；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20 min；PBS漂洗3次，2 min/次；DAB顯色，蘇木精復染。在光學顯微鏡下控制顯色時間，脫水、透明、封片。陰性對照用PBS代替一抗，按上述步驟同步進行。

1.2.6積分光密度值測量 在40倍鏡下，隨機選取ATN一個區(qū)域測量陽性神經(jīng)元的積分光密度值。

2 結(jié) 果

2.1何首烏對VD大鼠學習和記憶的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠明顯延長逃避潛伏期、縮短平臺象限游泳時間、減少穿過平臺次數(shù)；與模型組比較，何首烏明顯縮短d4逃避潛伏期、增加大鼠穿過平臺次數(shù)，延長平臺象限游泳時間。見表1。

表1 何首烏對VD大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期、平臺象限游泳時間、穿過平臺次數(shù)的影響

2.2何首烏對VD大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高；與模型組比較，何首烏升高SOD活性、降低MDA含量。見表2。

2.3各組大鼠ATN內(nèi)5-HT2A受體的免疫組化表達 抗5-HT2A受體的陽性細胞呈棕黃色，胞體呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)無色透明，胞核著藍色絲狀顆粒，細胞膜有環(huán)形黃帶。模型組與何首烏組、陽性對照組、正常組比較，抗5-HT2A受體的陽性細胞膜的環(huán)形帶染色較深、厚度增加。積分光密度值測量，模型組與何首烏組、陽性對照組、假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

表2 何首烏對VD大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

何首烏組

模型組

陽性對照組

假手術(shù)組

3 討 論

VD的發(fā)病機制主要包括神經(jīng)元能量衰竭、興奮性氨基酸毒性、細胞內(nèi)鈣超載、自由基產(chǎn)生、炎癥免疫反應、再灌注損傷等，但其發(fā)病機制尚未完全闡明。文獻〔7〕報道，5-HT系統(tǒng)受損與VD的認知功能下降及行為、情緒改變有關。服用5-HT受體阻滯劑可以改善病人的情緒障礙、改善病人的認知功能，其機制一方面與改善腦循環(huán)有關；另一方面與直接作用于5-HT受體，改善神經(jīng)傳遞功能有關。

丘腦內(nèi)部結(jié)構(gòu)十分復雜，是所有感覺入皮質(zhì)前的整合站，以往對癡呆的研究主要集中在海馬腦區(qū)，對丘腦研究甚少。學習、記憶等認知功能并不局限于大腦的某個特定區(qū)域，單一的腦區(qū)并不能獨立完成復雜的記憶功能，學習記憶的實現(xiàn)需要多個腦區(qū)的綜合作用〔8〕?，F(xiàn)已證明，海馬等邊緣皮質(zhì)和ATN與空間位置的學習記憶功能密切相關〔9，10〕。解剖學研究證明二者之間存在著雙向纖維聯(lián)系，ANT傳出纖維主要投射至海馬下腳Ⅰ～Ⅳ層，而海馬下腳返回纖維投射至ATN的背側(cè)和腹側(cè)。神經(jīng)生理學研究表明，這種回返纖維聯(lián)系的神經(jīng)元回路可能是學習記憶的結(jié)構(gòu)學基礎〔11〕。

何首烏對丘腦神經(jīng)元有保護、改善學習記憶的作用，其機制可能是5-HT神經(jīng)遞質(zhì)與突觸后膜5-HT2A受體結(jié)合后，經(jīng)G蛋白耦聯(lián)激活了腺苷酸環(huán)化酶，胞質(zhì)內(nèi)cAMP濃度增加，使蛋白激酶A(PKA)的調(diào)節(jié)亞單位和催化亞單位分離，催化亞單位使K+通道蛋白磷酸化導致通道關閉，從而促進Ca2+內(nèi)流增加、動作電位延長，使更多的突觸囊泡結(jié)合于釋放部位，有更多的神經(jīng)遞質(zhì)從神經(jīng)元釋放出來，使感覺神經(jīng)元的興奮性突觸后電位增強，從而促進學習記憶。但進一步的作用機制尚需實驗證實。

細胞氧化損傷是導致VD的一個早期因素〔12～14〕。SOD能夠清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷，其活性間接反映了機體清除氧自由基的能力。MDA是脂質(zhì)過氧化反應的代謝產(chǎn)物，其含量間接反映了細胞受自由基攻擊的脂質(zhì)過氧化程度。因此，SOD水平的高低和MDA含量能反映出腦組織細胞受氧化損傷的程度。本實驗驗證了VD患者SOD活性降低、MDA含量升高。

中藥治療缺血缺氧性腦病，可從多個不同環(huán)節(jié)阻止缺血缺氧觸發(fā)的病理生理和生物化學過程〔15〕。何首烏提取物中含有的蒽醌、二苯乙烯苷、卵磷脂等成分，能保護腦細胞、改善大鼠的學習記憶作用。

綜上所述，何首烏治療后，VD大鼠學習記憶行為能明顯改變，ATN內(nèi)5-HT2A受體表達可恢復到正常水平。

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