趙向寨 呂 欣 王 璟 田 瑛

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道惡性腫瘤，占女性癌癥6%〔1〕。腫瘤的預(yù)后與腫瘤細(xì)胞的惡性程度、侵襲、遷移能力息息相關(guān)〔2〕。探尋新的指標(biāo)研究子宮內(nèi)膜癌的高侵襲性、高遷移性是目前臨床專家的熱點(diǎn)問題。本研究沉默核不均一性核糖核蛋白H(hnRNP H)基因轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，觀察沉默hnRNP H對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響，檢測有關(guān)侵襲、遷移蛋白E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)型鈣黏著蛋白(N-cadherin)、基原金屬蛋白酶(MMP)-2及MMP-7的變化。

1 材料與方法

1.1材料 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自GIBCO公司；hnRNP H siRNA、Control siRNA-A、siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自Santa Cruz公司；E-cadherin、N-cadherin、MMP-2及MMP-7抗體購北京中山金橋有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，細(xì)胞經(jīng)10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5%CO2飽和度和濕度恒溫培養(yǎng)箱中孵育。0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。胰酶消化細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml，鋪于無菌6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h至Ishikawa細(xì)胞融合率達(dá)50%，棄去原細(xì)胞培養(yǎng)液，換無血清DMEM培養(yǎng)液，按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書要求用Transfection regent稀釋hnRNP H siRNA、Control siRNA及轉(zhuǎn)染試劑Transfection medium/regent。實(shí)驗(yàn)分組：正常培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞組(control)、轉(zhuǎn)染hnRNP H siRNA細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染Control siRNA細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染試劑作用6 h，無血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，換含血清、抗生素培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染24 h后，分別搜集細(xì)胞提取總RNA及總蛋白待測。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測hnRNP H、E-cadherin、N-cadherin、MMP-2及MMP-7 mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染后24 h，提取總RNA，測定A260/A280值介于1.8～2.0間。以β-actin作為內(nèi)參，總RNA 濃度為1 mg/ml進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將cDNA為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，目的基因30個(gè)循環(huán)，內(nèi)參循環(huán)數(shù)設(shè)定為25個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢，溶解曲線進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，利用CT值計(jì)算各組hnRNP H mRNA相對(duì)值。用2-△△CT表示。各目的基因引物序列hnRNP H：5′-TGCCAAATATGAATAACGACCCA-3′，5′-GAGAAA AGTGCTCGTCACTGT-3′,E-cadherin:5′-CATCTCAAGCTCGCGGATAA-3′，5′-CACCGTTCTCCTCCGTAGAAA-3′,N-cadherin:5′-CAACTTGCCAGAAAACTCCAGG-3′和5′-ATGAAACCGGGCTA TCTGCTC-3′,MMP-2:5′-CTATTCTGCCAGCACTTTGG -3′和5′-CAGACTTTGGTTCTCCAACTT -3′,MMP-7:5′-TGG GAACAGGC TCAGGACTATCT-3′和5′-TTCGGGTCTACACCTCACGG-3′，內(nèi)參引物序列5′-GGTCCTACGTTCACCAACACA -3′ 5′-CTCTGGGTCACATGGCTCT -3′。

1.4Western印跡法檢測hnRNP H、E-cadherin、N-cadherin、MMP-2及MMP-7 蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h后，提取各組細(xì)胞，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，于冰上進(jìn)行操作，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，各組取等量細(xì)胞總蛋白于12%+二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)至NC膜，含5%脫脂奶粉TBS室溫封閉1 h， hnRNP H(鼠抗1∶200，SANTA CRUZ)E-cadherin(兔抗1∶500，中山金橋)、N-cadherin(兔抗1∶500，中山金橋)、MMP-2(鼠抗1∶300，中山金橋)、MMP-7(鼠抗1∶300，中山金橋)和GAPDH(兔抗1∶2 000，Abcam)，4℃過夜；二抗(羊抗鼠或羊抗兔1∶5 000)37℃ 1.5 h；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色 ，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.5劃痕實(shí)驗(yàn) 分別用最佳濃度的Control siRNA及目的siRNA預(yù)處理的Ishikawa細(xì)胞，待細(xì)胞長滿90%后做劃痕試驗(yàn), 用10 μl槍頭在中間劃一橫線, 于24 h分別觀察照相，重復(fù)3次。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn) 將siRNA處理好的細(xì)胞含血清100 ml/L的DMEM培養(yǎng)基用懸浮, 以2×105接種于Fibronectin包被的Transwell孔板其中的12個(gè)Transwell上, 上室每孔加入100 μl,下室加入600 μl含血清200 ml/L的DMEM培養(yǎng)基，24 h后, 取出上室, 用棉簽蘸去上層的細(xì)胞, 加入100 ml/L新鮮配置的甲醛溶液固定30 min,然后用SyTOXGreen染色15 min。甘油封片后用熒光顯微鏡檢測細(xì)胞通過情況，平均每個(gè)小時(shí)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取平均值分析細(xì)胞的穿透能力。

2 結(jié) 果

2.1siRNA轉(zhuǎn)染后各組hnRNP H在mRNA及蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染hnRNP H siRNA 24 h后hnRNP H 表達(dá)明顯降低約為對(duì)照組的(19±2.3)% 。轉(zhuǎn)染hnRNP H siRNA 24 h后hnRNP H 表達(dá)在mRNA水平明顯降低約為對(duì)照組的(23±1.6)%。見圖1。

2.2實(shí)時(shí)定量PCR、Western印跡檢測三組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-7表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染hnRNP H siRNA 24 h后N-cadherin、MMP-2、MMP-7 表達(dá)明顯降低，分別約為對(duì)照組的(67±1.6)%，(59±1.8)%，(70±2.3)%。E-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)約為對(duì)照組的(25.6±7.9)%。轉(zhuǎn)染hnRNP H siRNA 24 h后N-cadherin、MMP-2、MMP-7在mRNA水平明顯降低，結(jié)果以2-△△CT表示分別為 0.43±0.164，0.38±0.124，0.54±0.102。見圖2。

圖1 各組hnRNP H mRNA表達(dá)

與Control組比較：1)P<0.05 與Control組比較：1)P<0.05

圖2各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-7表達(dá)

2.3劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell檢測細(xì)胞遷移能力的改變 劃痕后培養(yǎng)24 h后，三組細(xì)胞遷移率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 ) ， siRNA組細(xì)胞的遷移率(21.26±2.16)%明顯低于陰性對(duì)照組(59.17±1.4)%和對(duì)照組(74.75±3.49)%(P<0.05)。而陰性對(duì)照組和對(duì)照組的細(xì)胞遷移率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞遷移率

圖4 各組穿膜細(xì)胞數(shù)

Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后24 h，siRNA組穿膜細(xì)胞為(36±8)個(gè)，陰性對(duì)照組和對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(164±14)和(171±9)個(gè)，與陰性對(duì)照組和對(duì)照組比較，siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。而陰性對(duì)照組和對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

3 討 論

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)是上皮細(xì)胞在一定因素作用下，細(xì)胞間無緊密連接和黏附連接，且失去細(xì)胞極性，上皮細(xì)胞具有浸潤、游走遷徙的能力，從而上皮細(xì)胞變成具有間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特性的一類細(xì)胞，代表標(biāo)志物：E-cadherin、N-cadherin。研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)缺失是EMT的關(guān)鍵特征〔3，4〕，也是判斷是否發(fā)生EMT〔5，6〕的標(biāo)志指標(biāo)，E-cadherin是維持上皮形態(tài)及細(xì)胞間黏附連接的重要黏附分子。其中在乳腺癌、卵巢癌、泌尿生殖系統(tǒng)等多種癌癥都已證實(shí)E-cadherin表達(dá)缺失〔7，8〕。

綜上，沉默hnRNP H基因能抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲。

4 參考文獻(xiàn)

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