陳文龍 曹文富 何 英 高世嬌

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016)

肝纖維化是肝組織對(duì)慢性、反復(fù)性損傷的修復(fù)反應(yīng)，是多種類(lèi)型細(xì)胞、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等共同參與的一系列復(fù)雜作用的結(jié)果，以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的過(guò)度增生與異常沉積為主要特征〔1〕。無(wú)論何種原因引起的慢性肝臟損傷都涉及肝纖維化過(guò)程〔2〕。目前單純西醫(yī)治療肝纖維化手段有限。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法中藥煎劑可以降低肝組織內(nèi)纖維化程度，且以益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰四法合用作用最強(qiáng)〔3〕。近年來(lái)，有越來(lái)越多的研究表明，肝纖維化發(fā)生機(jī)制與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)密切相關(guān)〔4〕。因此，本研究擬在既往研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察不同劑量益氣化瘀化痰養(yǎng)陰方藥對(duì)肝纖維化大鼠肝組織結(jié)構(gòu)及PPARγ表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器 本試驗(yàn)所需中藥飲片均購(gòu)自于重慶桐君閣大藥房，秋水仙堿由云南植物藥業(yè)公司生產(chǎn)；PPARγ一抗、二抗及Western印跡試劑盒均購(gòu)自于北京中杉公司，Trizol總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑均由Takara公司生產(chǎn)，普通PCR儀、凝膠成像儀為BIO-RAD公司，紫外公光光度儀為Beckman公司，H-7500型電鏡為日本日立公司生產(chǎn)。

1.2肝纖維化造模方法 參考文獻(xiàn)〔5〕方法，大鼠皮下注射CCl4溶液，首劑量為5.0 ml/kg體重，以后每隔3 d皮下注射40%CCl4橄欖油溶液(劑量0.3 ml/100 g)，持續(xù)4 w。造模開(kāi)始2 w給予高脂、低蛋白質(zhì)復(fù)合飼料(豬油20%+膽固醇0.5%+玉米粉79.5%)，2 w后改用普通飼料，6 w造模期間用10%白酒作為唯一飲料。

1.3動(dòng)物分組 雄性SD大鼠110只，體重180～220 g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔許可證號(hào)：SYXK(渝)2007-0001〕，于重慶醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)室采用12 h自動(dòng)光暗交替，相對(duì)濕度55%，溫度(23±2)℃。動(dòng)物在適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將大鼠隨機(jī)分為正常組、肝纖維化模型組、秋水仙堿組、益氣化瘀化痰養(yǎng)陰低劑量組、中劑量組及高劑量組。除正常組外，其余各組均制備肝纖維化模型，造模結(jié)束后隨機(jī)取2只大鼠行HE染色進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4動(dòng)物處理 (1)正常組及肝纖維化模型組灌服生理鹽水(3 ml/100 g，1次/d)；(2)秋水仙堿組給予秋水仙堿水溶液灌胃(0.01 mg/100 g，1次/d)；(3)益氣化瘀化痰養(yǎng)陰低、中、高劑量組分別給予1、2、4 g/ml煎劑(3 ml/100 g，1次/d)。12 w后處死大鼠。

1.5中藥制備 精選黃芪、白術(shù)、川芎、姜黃、半夏、海藻、白芍、鱉甲(藥物比例2∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶2)，混合水提并濃縮成益氣化瘀化痰養(yǎng)陰中藥煎劑，低、中、高劑量中藥煎劑每毫升分別含生藥1、2、4 g。

1.6標(biāo)本采集與處理 最后一次用藥后24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，于冰盒上處死大鼠，摘取肝臟，取部分肝組織分別用10%甲醛和4%戊二醛固定，待做HE染色及電鏡檢查，其余標(biāo)本于液氮中冷凍后再轉(zhuǎn)移到-70℃冰箱中保存。

1.7觀察指標(biāo)

1.7.1光鏡觀察 肝組織用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片、HE染色及Masson染色，光鏡觀察肝組織病理結(jié)構(gòu)，采用METAVIR評(píng)分系統(tǒng)〔6〕把肝纖維化分為4級(jí)。

1.7.2電鏡觀察 活體大鼠麻醉后取下1 mm3肝組織，立即放入4℃ 4%戊二醛溶液中固定2 h，0.1 mmol/L PBS液清洗3次，4℃ 1%四氧化鋨溶液中固定2 h，常規(guī)乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂浸透、包埋、聚合，制備0.5 μm厚度半薄切片，在光鏡下定位后再制備60 nm厚度超薄切片，再經(jīng)醋酸鈾、枸椽酸鉛染色，H-7500型電鏡觀察。

1.7.3RT-PCR法檢測(cè)肝組織PPARγ mRNA表達(dá) 根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)，提取大鼠肝組織總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)RNA濃度和純度，42℃ 20 min條件下逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PPARγ正義：5′-CCTTTACCACGGTTGATTTCTC-3′，反義：5′-TTCAATCGGATGGTTCTTCG-3′，目的片段為319 bp，退火溫度53.8℃。內(nèi)參GAPDH正義：5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT-3′，反義：5′-GTGGAAGAATGGGAGTTGCTGT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度610 bp，退火溫度58.5℃。PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94℃ 3 min；94℃ 30 s，53.8℃(內(nèi)參為58.5℃)30 s，72℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，并將凝膠置于凝膠成像儀上用Quantityone 4.6圖像分析軟件進(jìn)行照相分析。各條帶的相對(duì)光密度值=目的條帶光密度值/內(nèi)參GAPDH條帶光密度值。

1.7.4Western印跡法檢測(cè)肝組織PPARγ蛋白表達(dá) 稱(chēng)取一定量的肝臟組織，加入10倍體積的組織裂解液勻漿，冰浴30 min后，4℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清，BCA試劑盒蛋白定量，組織總蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性。30 g蛋白經(jīng)15%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)，3%BSA室溫封閉2 h，加入一抗4℃過(guò)夜，TBS-Tween洗膜后加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，加入ECL發(fā)光液，經(jīng)EC檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各組PPARγ蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大鼠死亡率約為26.3%，僅正常組大鼠無(wú)死亡，各組大鼠存活率無(wú)明顯差異。正常組大鼠體重明顯增加，體格健壯，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)有光澤；模型組大鼠瘦弱，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)干枯無(wú)光澤，部分毛發(fā)打結(jié)，食欲差，腹部略顯飽滿(mǎn)，其余各治療組均較模型組有不同程度好轉(zhuǎn)。

2.2不同劑量益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法中藥對(duì)肝組織病理形態(tài)的影響

2.2.1光鏡觀察 (1)HE染色及Masson染色：正常組大鼠肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞呈多邊形，無(wú)變性、壞死，有1～2個(gè)圓形細(xì)胞核，核仁明顯，核內(nèi)染色質(zhì)稀疏，染色較淺，胞質(zhì)豐富；模型組可見(jiàn)肝纖維化間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)大量大小不等空泡，細(xì)胞核被擠壓到細(xì)胞邊緣，并可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且以匯管區(qū)最明顯；秋水仙堿組肝細(xì)胞內(nèi)空泡較模型組明顯減少；益氣化瘀化痰養(yǎng)陰中藥中、高劑量組肝組織形態(tài)基本正常，僅于匯管區(qū)有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而益氣化瘀化痰養(yǎng)陰中藥低劑量組與模型組形態(tài)較接近。見(jiàn)圖1。(2)肝纖維化程度：各組之間纖維化程度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.539,P=0.00)。肝纖維化程度順序?yàn)椋耗Ｐ徒M>中藥低劑量組>秋水仙堿組>中藥中劑量組>中藥高劑量>正常組。其中，中藥低劑量與模型組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.162)，與中藥中、高劑量組相比具有顯著差異(P=0.00)，中藥中劑量與高劑量差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.688)。見(jiàn)表1。

Ⅰ:正常組；Ⅱ:模型組；Ⅲ:秋水仙堿組；Ⅳ:中藥低劑量組；Ⅴ:中藥中劑量組；Ⅵ:中藥高劑量組；下圖同

表1各組大鼠肝纖維化METAVIR評(píng)分比較(n)

組別nMETAVIR評(píng)分0級(jí) 1級(jí) 2級(jí) 3級(jí) 4級(jí)平均Ridit值正常組101000000.175模型組11001820.8561)秋水仙堿組15156300.5941)2)中藥低劑量組13014710.7681)中藥中劑量組15852000.3321)2)中藥高劑量組16961000.3101)2)合計(jì)802817141830.5001)2)

2.2.2電鏡觀察 正常組肝細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞間緊密連接，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及核蛋白體豐富，毛細(xì)膽管微絨毛豐富，形態(tài)正常；模型組及中藥低劑量組可見(jiàn)肝纖細(xì)內(nèi)大量脂滴，細(xì)胞核基本正常，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器腫脹且數(shù)量明顯減少，糖原稀疏，并可見(jiàn)較多成纖維細(xì)胞及少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，周?chē)梢?jiàn)大量纖維沉積；秋水仙堿組、中藥中劑量及高劑量組形態(tài)與正常組形態(tài)相似。見(jiàn)圖2。

(×15 000) (×10 000) (×10 000)

(×12 000) (×10 000) (×15 000)

2.3不同劑量益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法中藥對(duì)肝組織PPARγ的影響

2.3.1肝組織PPARγ mRNA表達(dá) 模型組〔(42.46±8.00)%〕及中藥低劑量組〔(42.45±7.09)%〕肝組織PPARγ mRNA含量低于正常組〔(59.03±9.64)%〕，而中藥中、高劑量組〔(65.86±5.97)%、(66.54±7.33)%〕高于正常組。對(duì)肝組織PPARγ mRNA相對(duì)濃度進(jìn)行方差分析(F=30.75,P<0.01)，顯示模型組、各治療組肝組織PPARγ mRNA與正常組比較差異顯著(P<0.05)，且以模型組和中藥低劑量組降低最明顯(P=0.00)；與模型組相比，中藥低劑量組〔(51.88±5.66)%〕PPARγ mRNA無(wú)明顯升高(P=0.99)，而秋水仙堿〔(51.88±5.66)%〕以及中藥中、高劑量組明顯升高，以中藥中、高劑量升高最明顯(P=0.00)，中藥中劑量與高劑量組之間無(wú)明顯差異(P=0.792)。見(jiàn)圖3A。

2.3.2不同劑量益氣化瘀化痰養(yǎng)陰中藥對(duì)肝組織PPARγ蛋白表達(dá)的影響 各組大鼠肝組織PPARγ蛋白表達(dá)情況與肝組織內(nèi)PPARγ mRNA水平基本一致(F=21.34,P<0.01)。肝纖維化模型組中PPARγ蛋白表達(dá)最少(0.28±0.09)，其次為中藥低劑量組(0.31±0.06)，且這兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.50)；中藥中劑量與高劑量組肝組織PPARγ蛋白含量(0.53±0.10、0.54±0.10)接近正常組(P=0.59，0.73)，中藥中劑量及高劑量組也無(wú)明顯差異(P=0.84)。正常組及秋水仙堿組分別為0.55±0.10，0.43±0.090，見(jiàn)圖3B。

圖3 肝組織PPARγ mRNA、蛋白含量

3 討 論

肝纖維化的形成是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，是諸多慢性肝病向肝硬化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)，早期有效地控制并逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程對(duì)阻止肝硬化具有重要意義。然而，目前尚無(wú)切實(shí)有效的肝纖維化治療方案〔7〕。

近年來(lái)，PPARγ及其配體在肝纖維化中的作用越來(lái)越受到重視。許多研究表明，PPARγ及其配體參與了肝星狀細(xì)胞(HSC)向肌成纖維細(xì)胞(MFB)轉(zhuǎn)變的TGF-β信號(hào)通路、肝生長(zhǎng)因子(HGF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)信號(hào)通路及瘦素、脂聯(lián)素等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多信號(hào)通路〔4，8〕。在這些通路中，PPARγ的表達(dá)、活化與HSC的活化、增殖，ECM沉積、降解以及肝纖維化的發(fā)展密切相關(guān)。

我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，中、高劑量益氣化瘀化痰養(yǎng)陰中藥可提高肝纖維化模型大鼠肝組織內(nèi)PPARγ mRNA水平，PPARγ蛋白較正常組有增高趨勢(shì)，但組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者變化不一致。出現(xiàn)上述表現(xiàn)的原因，我們推測(cè)一方面可能是外源性配體競(jìng)爭(zhēng)性抑制內(nèi)源性配體，使PPARγ蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變〔9〕，導(dǎo)致PPARγ蛋白表達(dá)相對(duì)減少；另一方面可能是肝纖維化時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化和以TNF-α為主的炎性介質(zhì)釋放皆可激活ERK信號(hào)通路，由ERK通路介導(dǎo)的磷酸化反應(yīng)能通過(guò)對(duì)PPARγ的磷酸化降低PPARγ轉(zhuǎn)錄活性〔10〕。但具體原因有待進(jìn)一步研究。

雖然傳統(tǒng)中醫(yī)并無(wú)“肝纖維化”這一概念，但歷代醫(yī)家對(duì)其證候、病因病機(jī)、防治措施等早有論述，主要散在于“黃疸”、“脅痛”、“積聚”、“鼓脹”等疾病。2006年，中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)肝病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)制定了《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南》，將肝纖維化證候歸納為氣陰虛損和瘀血組絡(luò)2個(gè)基本證型以及肝膽濕熱、肝郁脾虛、肝腎陰虛3個(gè)常見(jiàn)證型〔11〕。臨床發(fā)現(xiàn)痰濁壅滯也是肝纖維化的常見(jiàn)證型〔12〕。我們認(rèn)為肝纖維化基本病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛主要是指氣虛與陰虛，標(biāo)實(shí)主要是指瘀血及痰濁。“氣虛與陰虛并見(jiàn)，痰凝與瘀血互結(jié)”既然為肝纖維化的基本病機(jī)，就可按益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法立法論治。

本研究選用益氣藥(黃芪、白術(shù))、活血化瘀藥(川芎、姜黃)、化痰藥(半夏、海藻)、養(yǎng)陰藥(白芍、鱉甲)，其中黃芪具有益氣健脾、升陽(yáng)舉陷、益衛(wèi)固表、利水消腫的功效，是臨床上最常用的益氣藥物之一；白術(shù)能益氣健脾、燥濕利水，與黃芪配伍使用，能增強(qiáng)益氣健脾、利濕之功；川芎能活血祛瘀、行氣開(kāi)郁、祛風(fēng)止痛，為“血中之氣藥”；姜黃“主心腹結(jié)積，下氣，破血，消癰腫”(出自《新修本草》)。半夏燥濕化痰，消痞散結(jié)，為化痰要藥；海藻能消痰散結(jié)軟堅(jiān)，利水消腫；白芍養(yǎng)血柔肝，緩中止痛，斂陰收汗，是最常見(jiàn)的養(yǎng)陰柔肝藥之一；鱉甲滋陰潛陽(yáng)，軟堅(jiān)散結(jié)。益氣藥黃芪、白術(shù)與化痰藥半夏、海藻配伍，能協(xié)同發(fā)揮益氣健脾、化痰散結(jié)作用；與化瘀藥川芎、姜黃配伍，共同顯示益氣化瘀化痰功效；再與養(yǎng)陰藥白芍、鱉甲配伍共湊養(yǎng)氣養(yǎng)陰、柔肝散結(jié)之功效。一是通過(guò)益氣養(yǎng)陰法扶助正氣，使津氣血津液能正常運(yùn)行，從而杜絕痰濁與瘀血的生成；二是以化瘀化痰法促進(jìn)已成之“痰濁與瘀血”消散化除，使處于痰濁凝聚與痰瘀互結(jié)病理進(jìn)程的肝組織結(jié)構(gòu)及功能復(fù)原的目的。諸多國(guó)內(nèi)研究已表明以上八味中藥可以有效抑制或者調(diào)節(jié)參與各種器官纖維化中的關(guān)鍵因子，如TGF-β1、TIMP-1、 MMPs等〔13～15〕。而對(duì)PPARγ等較新的、在纖維化過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用的指標(biāo)研究甚少。

本文結(jié)果顯示，中高劑量益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法中藥能增加肝組織內(nèi)PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)，對(duì)肝纖維大鼠具有治療作用，而低劑量治療效果不明顯。這可能是因?yàn)橐鏆饣龌叼B(yǎng)陰法中藥的治療效果呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，低劑量中藥不足以增強(qiáng)肝組織內(nèi)PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)。然而，本研究目前僅設(shè)立了三個(gè)劑量組，且無(wú)血藥濃度監(jiān)測(cè)，缺乏益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法中藥抗肝纖維化劑量-效應(yīng)關(guān)系方面的具體數(shù)據(jù)。

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