王 蒙 楊 超 劉運(yùn)江

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心，河北 石家莊 050011)

大量臨床研究證明乳腺癌是一種全身性疾病，早期即可發(fā)生淋巴、血行轉(zhuǎn)移〔1〕。乳腺癌在發(fā)病初期即可以在外周血中檢測(cè)到循環(huán)腫瘤細(xì)胞，可能已有潛伏的微轉(zhuǎn)移。微轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要原因，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的存在與腫瘤患者復(fù)發(fā)和預(yù)后都有密切聯(lián)系。腫瘤干細(xì)胞(TSC)的提出又為腫瘤早期微轉(zhuǎn)移提供了新的理論基礎(chǔ)。乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的檢測(cè)對(duì)于腫瘤的預(yù)防、診斷及治療都具有重要意義〔2，3〕。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者外周血中存在循環(huán)腫瘤細(xì)胞，但大部分循環(huán)腫瘤細(xì)胞在血液循環(huán)中很快會(huì)凋亡，即使到達(dá)遠(yuǎn)處器官組織也無法形成轉(zhuǎn)移灶。本研究檢測(cè)原發(fā)性乳腺癌患者中的CTC和TSC。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心2010年9月至2011年2月44例初治原發(fā)性女性乳腺癌患者，均經(jīng)臨床檢查及細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)檢查確診，抽血前未經(jīng)任何治療。年齡51～67歲，臨床分期Ⅰ期12例，Ⅱ期18例，Ⅲ期14例；ER陽性33例，陰性11例；PR陽性33例，陰性11例；C-erbB2陽性6例，陰性24例。另選取15例正常女性志愿者為陰性對(duì)照組。

1.2主要試劑和設(shè)備 Anti-FITC MicroBdads(德國(guó)美天旎公司)、Mouse monoclonal to Cytokeratin 19(FITC)和Rat monoclonal to CD44(FITC)(英國(guó)Abcam公司)、CD24 Antibody(FITC)(美國(guó)Novus Biologicals公司)、人中性粒細(xì)胞分離液(FICOLL)(上海易佰聚生物公司)、熒光顯微鏡(日本奧林巴斯 BX51T-PHD-J11) 分選架、磁鐵和分選柱(德國(guó)美天旎公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液(PBMC)制備 將外周血、生理鹽水及人中性粒細(xì)胞分離液(FICOLL)按1∶1∶1混勻，上離心機(jī)2 500 r/min離心15 min，吸白膜層。再離心(1 500 r/min，5 min)2次，去上清。

1.3.2CK19陽性(CK19+)細(xì)胞標(biāo)記和磁性分選

1.3.2.1CK19+細(xì)胞標(biāo)記 將CK19-FITC和抗FITC磁珠加入分離所得單個(gè)核細(xì)胞，加入緩沖液至補(bǔ)足體積，每107細(xì)胞(1∶11)混勻，4～8℃避光孵育10 min。加入10～20倍標(biāo)記體積的緩沖液洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，完全去除上清(重復(fù)洗滌1次)。每108細(xì)胞用500 μl緩沖液重懸。進(jìn)行磁性分選。

1.3.2.2磁性分選 將MS分選柱放置在適當(dāng)MACS分選器的磁場(chǎng)中，用500 μl緩沖液潤(rùn)濕分選柱，將磁性標(biāo)記后的細(xì)胞加入分選柱上，進(jìn)行細(xì)胞分選。收集先行流出的未標(biāo)記細(xì)胞，用適量緩沖液沖洗分選柱。在分選柱下放置適當(dāng)?shù)牟杉?，在分選柱內(nèi)加入緩沖液，用分選柱配備的活塞迅速推出磁性標(biāo)記細(xì)胞。

1.3.2.3陽性細(xì)胞制片、圖像采集 將磁性分選所得陽性細(xì)胞離心(1 500 r/min，5 min)，去上清，10 μl PBS混勻，離心涂片(1 000 r/min，2 min)，在熒光顯微鏡下按臨床組織病理學(xué)觀察方法掃描完整的細(xì)胞涂片視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞總數(shù)，選取單個(gè)視野最多的陽性細(xì)胞進(jìn)行采圖、保存。采圖后的涂片，使用1%甲醇室溫固定15 min。4℃保存5 d。

1.3.3CD44+/CD24-/low細(xì)胞檢測(cè) 涂片上滴加CD44-FITC抗體，37℃，30 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。涂片上滴加CD24-FITC抗體，37℃，30 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。在熒光顯微鏡下按臨床組織病理學(xué)觀察方法掃描完整的細(xì)胞涂片視野，記陽性細(xì)胞總數(shù)。選取單個(gè)視野最多的陽性細(xì)胞進(jìn)行采圖、保存。

1.4其他檢測(cè)指標(biāo)及方法 所得細(xì)胞計(jì)數(shù)根據(jù)TNM分期、ER、PR、C-erbB2、Ki-67、分子分型等進(jìn)行分析。TNM分期根據(jù)2003年WHO乳腺癌TNM分期作為標(biāo)準(zhǔn)；ER、PR、Ki-67根據(jù)免疫組織化學(xué)檢測(cè)所得結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)；C-erbB2根據(jù)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果及Fish檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組PBMC檢測(cè)結(jié)果 15例正常女性志愿者PBMC中未檢測(cè)到CK19+細(xì)胞，44例原發(fā)性乳腺癌患者33例(75.00%)患者PBMC中檢測(cè)到CK19+細(xì)胞(圖1)。兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 CK19陽性細(xì)胞 圖2 CD44+/CD24-/low細(xì)胞 圖3 CD24+細(xì)胞

2.2不同病理分期CK19+細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 Ⅰ期患者12例，5例外周血中檢測(cè)到CK19+細(xì)胞(41.67%)；Ⅱ期患者18例，15例外周血中檢測(cè)到CK19+細(xì)胞(83.33%)；Ⅲ期患者14例，13例外周血中檢測(cè)到CK19+細(xì)胞(92.86%)。χ2檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移層次CK19+細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 N024例，15例檢測(cè)到CK19+細(xì)胞(62.50%)；N1-320例，18例檢測(cè)到CK19陽性細(xì)胞(90.00%)。χ2檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.4CD44+/CD24-/low、CD29+細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 33例CK19+樣本中21例(63.63%)檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞，CD24+細(xì)胞所示(見圖2、圖3)。按臨床病理分期分為3組：Ⅰ期患者2例檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞(2/5,40.00%)；Ⅱ期患者10例檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞(10/15,66.67%)；Ⅲ期患者9例檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞(9/13,69.23%)。χ2檢驗(yàn)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同臨床分期原發(fā)性乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)比較

2.5不同臨床特征中CK19陽性率比較 ER陽性樣本33例，24例檢測(cè)到CK19+細(xì)胞(72.73%)，15例檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞(15/24，62.50%)；ER陰性樣本11例，9例檢測(cè)到CK19+細(xì)胞(81.82%)，6例檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞(6/9，66.67%)。χ2檢驗(yàn)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。C-erbB2陽性樣本6例，4例檢測(cè)到CK19陽性細(xì)胞(66.67%)，2例檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞(2/4，50.00%)；C-erbB2陰性樣本24例，16例檢測(cè)到CK19陽性細(xì)胞(66.67%)，11例檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞(11/16，68.75%)。χ2檢驗(yàn)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？梢娒}管瘤栓樣本13例，9例檢測(cè)到CK19陽性細(xì)胞(69.23%)，8例檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞(8/9，88.89%)；未見脈管瘤栓樣本31例，24例檢測(cè)到CK19陽性細(xì)胞(77.42%)，13例檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞(13/24，54.17%)。χ2檢驗(yàn)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6根據(jù)分子亞型分組結(jié)果比較 將樣本分為三型：三陰乳腺癌(ER、PR陰性，C-erbB2經(jīng)FISH法檢測(cè)陰性)、ER陽性(ER和/或PR陽性)、C-erbB2陽性(ER、PR陰性，C-erbB2經(jīng)FISH法檢測(cè)陽性)。三陰樣本5例，5例檢測(cè)到CK19+細(xì)胞(100.00%)，4例檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞(4/5，80.00%)；ER陽性樣本19例，11例檢測(cè)到CK19+細(xì)胞(57.89%)，7例檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞(7/11，63.64%)；C-erbB2陽性樣本4例，3例檢測(cè)到CK19+細(xì)胞(75.00%)，2例檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞(2/3，66.67%)。χ2檢驗(yàn)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

CTC是分析惡性腫瘤生物學(xué)特性和轉(zhuǎn)移行為的一個(gè)有效窗口〔4〕。大部分腫瘤細(xì)胞處于不增殖或有限增殖狀態(tài)，但腫瘤干細(xì)胞具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移侵襲能力〔5〕，原發(fā)性乳腺癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的出現(xiàn)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著密切的聯(lián)系〔6～8〕，國(guó)內(nèi)任傳利等〔8〕建立EpCAM抗體耦聯(lián)納米磁珠陽性分離乳腺癌等實(shí)體腫瘤中CTC檢出率均不低于50%，而且隨著腫瘤分期增加，CTC檢出率顯示出增加的趨勢(shì)，外周血中CTC的出現(xiàn)意味著早期微轉(zhuǎn)移的存在。但循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的存在不一定意味著轉(zhuǎn)移灶的形成，Al-Hajj等〔9〕研究顯示乳腺癌細(xì)胞中有一群表型為CD44+/CD24-/low的細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特征，首先證實(shí)了乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的存在。腫瘤干細(xì)胞(TSC)學(xué)說認(rèn)為，大部分循環(huán)腫瘤細(xì)胞并不具有分化增殖能力或具有有限增殖能力，只有一部分腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素〔8〕。只有腫瘤干細(xì)胞具有瘤形成能力，才能夠到達(dá)遠(yuǎn)處組織器官形成轉(zhuǎn)移灶，因此檢測(cè)外周血中腫瘤干細(xì)胞的存在更具有臨床意義。

細(xì)胞角蛋白(CK)是檢測(cè)乳腺癌的一個(gè)特異性較高的標(biāo)記物，CK19是最常見的角蛋白之一，在腫瘤細(xì)胞中含量豐富〔9〕。本實(shí)驗(yàn)表明循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性率與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。臨床分期越晚，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性率越高，Ⅰ期患者的外周血中亦檢測(cè)到CK19+細(xì)胞，表明在乳腺癌發(fā)病的初期外周血中即已經(jīng)存在循環(huán)腫瘤細(xì)胞。ER陰性的樣本中，CK19細(xì)胞的陽性率在ER陽性樣本、C-erbB2陽性、Ki-67高表達(dá)和三陰性乳腺癌樣本中均較高，表明循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性率與ER、C-erbB2、Ki-67、分子分型等有著密切聯(lián)系。

以CD44+/CD24-/low細(xì)胞作為外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志〔9〕。CK19+細(xì)胞中CD44+/CD24-/low細(xì)胞的檢測(cè)采用免疫熒光雙染色。33例CK19+細(xì)胞樣本中21例檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞(63.63%)。可見外周血微轉(zhuǎn)移與腫瘤干細(xì)胞有著密切聯(lián)系，且腫瘤干細(xì)胞對(duì)于外周血微轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)起著重要的作用。臨床分期越晚，腫瘤干細(xì)胞出現(xiàn)的數(shù)量越多，TSC所占CSC的比例越高。本實(shí)驗(yàn)Ⅰ期患者的外周血中亦檢測(cè)到CD44+/CD24-/low細(xì)胞，說明在乳腺癌發(fā)病的初期已經(jīng)是全身性疾病，已經(jīng)可能有潛在微轉(zhuǎn)移的存在。循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存在并不一定意味著腫瘤干細(xì)胞的存在，表明循環(huán)腫瘤細(xì)胞在外周血中大部分趨于凋亡，而腫瘤干細(xì)胞由于具有干細(xì)胞特性而在外周血中免于凋亡。有研究表明骨髓中存在彌散腫瘤細(xì)胞(DTC)的樣本中均可以檢測(cè)到腫瘤干細(xì)胞，且比例高達(dá)72%〔10〕，表明外周血中的非腫瘤干細(xì)胞趨于凋亡，只有具有干細(xì)胞特性的腫瘤干細(xì)胞能夠進(jìn)入骨髓。

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