趙朝華 吳樹(shù)強(qiáng) 楊 杰 茍興春 張軍鋒 楊吉平 史利利

(西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，陜西 西安 710021)

研究發(fā)現(xiàn)天麻素具有擴(kuò)張腦血管、提高腦細(xì)胞抗缺氧能力、減小腦缺血后梗死體積，抑制細(xì)胞凋亡等神經(jīng)保護(hù)作用〔1〕。腦缺血再灌注損傷過(guò)程非常復(fù)雜，而此損傷發(fā)生后 S100β在腦內(nèi)表達(dá)和血清中濃度的改變不僅是腦缺血損傷的重要病理學(xué)指標(biāo)〔2〕，而且其表達(dá)量的多少顯著影響腦缺血損傷的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。缺血再灌注后過(guò)表達(dá)的S100β蛋白對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有毒性作用〔3〕，可加重腦損傷。而天麻素對(duì)腦缺血再灌注后S100β的表達(dá)有何影響并未見(jiàn)較為系統(tǒng)研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注模型來(lái)明確天麻素對(duì)S100β的表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討天麻素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，鼠齡8～12 w，體重240～280 g，實(shí)驗(yàn)前常規(guī)環(huán)境分籠飼養(yǎng)至少7 d。天麻素組(n=4)于造模前3 d每日腹腔注射天麻素注射液(中山市三才醫(yī)藥有限公司)100 mg/kg 1次，對(duì)照組(n=4)注射等體積生理鹽水。參考Longa等〔4〕描述的管腔內(nèi)線栓技術(shù)閉塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈(MACO)誘導(dǎo)建立暫時(shí)性局部腦缺血大鼠模型。簡(jiǎn)要過(guò)程：大鼠做頸部前正中切口，分離暴露右側(cè)頸部血管，用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，將一頭端加熱呈光滑球形的3-0尼龍線(寧波醫(yī)用縫線廠)經(jīng)頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈至感到有輕微阻力為止，進(jìn)線長(zhǎng)約18 mm左右。栓塞2 h后輕輕抽出尼龍線至頸外動(dòng)脈切口處。手術(shù)期間使用電熱毯維持大鼠體溫在36.5～37.5℃。常規(guī)環(huán)境下飼養(yǎng)。大鼠分別存活1、3和7 d。

1.2方法

1.2.1神經(jīng)功能學(xué)評(píng)價(jià) MCAO后2 h參照文獻(xiàn)〔5〕方法進(jìn)行神經(jīng)功能損傷程度的評(píng)定，即0級(jí)：行為正常；1級(jí)：提尾懸空左側(cè)前肢屈曲，肩內(nèi)收；2級(jí)：抵抗對(duì)側(cè)推力下降，伴前肢屈曲；3級(jí)：自發(fā)性側(cè)向旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，伴抵抗對(duì)側(cè)推力下降和前肢屈曲。評(píng)定為3級(jí)者視為成功腦缺血模型，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2S100β免疫組織化學(xué)染色 各組于缺血后1、3和7 d分別取大鼠4只，常規(guī)灌注固定，斷頭取腦，石蠟包埋、切片(片厚8 μm)，用于S100β免疫組化染色(S100β單克隆抗體和SABC二抗試劑盒均購(gòu)自武漢Boster公司)。

1.2.3細(xì)胞計(jì)數(shù) 每只大鼠取4張切片，在20倍物鏡下通過(guò)Motic Images Advanced 3.0 圖像分析系統(tǒng)在缺血邊緣區(qū)選取4個(gè)等面積視野區(qū)，計(jì)數(shù)S100β陽(yáng)性細(xì)胞(胞體完整，呈棕色或棕黑色)數(shù)，結(jié)果平均后即為1張腦片的S100β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.4血清S100β含量測(cè)定 動(dòng)物處死前，均經(jīng)右心室取血1.5 ml,分離血清，-20℃凍存。所得血清通過(guò)ELISA檢測(cè)S100β含量。操作按試劑盒(第四軍醫(yī)大學(xué)生理教研室提供)說(shuō)明進(jìn)行。S100β單克隆抗體和S100β多克隆抗體均由自武漢Boster公司提供。

2 結(jié) 果

2.1缺血邊緣區(qū)S100β陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)目變化 免疫組織化學(xué)染色顯示，對(duì)照組腦缺血再灌注后1 d S100β陽(yáng)性細(xì)胞在缺血中心區(qū)基本消失，偶見(jiàn)形態(tài)不完整似將裂解的細(xì)胞胞體輪廓，而在缺血邊緣區(qū)出現(xiàn)許多胞體肥大呈圓形的S100β陽(yáng)性細(xì)胞(20.01±3.87)。天麻素組S100β陽(yáng)性細(xì)胞(16.16±3.59)明顯少于對(duì)照組(圖1)。3 d時(shí)對(duì)照組為(31.43±3.01)，3 d時(shí)缺血邊緣區(qū)可見(jiàn)大量肥大的S100β陽(yáng)性細(xì)胞，突起增多，數(shù)目明顯增加(24.39±2.86，圖1)。S100β陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示腦缺血再灌注后1 d S100β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目天麻素組均少于對(duì)照組(24.39±2.86,P<0.05)。

2.2血清S100β的含量變化 對(duì)照組大鼠腦缺血后1 d時(shí)血清S100β含量顯著升高(正常大鼠血清S100β含量本實(shí)驗(yàn)未能測(cè)出)，ELISA檢測(cè)值為(9.12±1.65)μg/L，3 d明顯降低，測(cè)定值為(2.83±0.98)μg/L，較1 d時(shí)有顯著性差異(P<0.05)。天麻素組血清S100β含量1 d亦明顯增高，檢測(cè)值為：(6.76±1.97)μg/L，3 d為(1.49±0.88)μg/L。天麻素組的S100β含量均顯著低于缺血組(P<0.05)。

對(duì)照組1 d

天麻素組1 d

對(duì)照組3 d

天麻素組3 d

3 討 論

腦缺血缺氧可刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，產(chǎn)生更多的S100β〔6〕，加上從損傷的膠質(zhì)細(xì)胞漏出的S100β〔7〕，在缺血邊緣區(qū)將存在高濃度(在μmol范圍)的S100β，而高濃度S100β具有神經(jīng)毒性，可升高神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的濃度，引起鈣超載，誘導(dǎo)培養(yǎng)的(AS)表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)，并進(jìn)而生成NO，導(dǎo)致(AS)和培養(yǎng)的神經(jīng)元死亡〔8〕。高表達(dá)的S100β還能促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素(IL)-1，IL-1又能強(qiáng)烈刺激AS活化和增殖，產(chǎn)生大量的S100β〔9〕。S100β自身也能促進(jìn)AS肥大增殖，產(chǎn)生更多的S100β蛋白，這是一個(gè)復(fù)雜的鏈條，S100β在這個(gè)復(fù)雜的過(guò)程中扮演主要角色。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明可能通過(guò)以上機(jī)制過(guò)表達(dá)的S100β加重了腦缺血損傷后神經(jīng)功能缺失及遲發(fā)性梗死灶的擴(kuò)展〔10～12〕。Mori等〔3〕應(yīng)用高表達(dá)S100β的轉(zhuǎn)基因大鼠研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)S100β的大鼠較對(duì)照組腦梗死體積顯著增加，神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重，缺血半暗帶膠質(zhì)瘢痕過(guò)度增生。從而更加證實(shí)了S100β過(guò)表達(dá)對(duì)腦缺血后神經(jīng)毒害作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示天麻素可能在缺血再灌注早期對(duì)S100β的表達(dá)有抑制作用。從而可能抑制或減少由于腦缺血損傷后S100β蛋白含量的升高而使腦組織進(jìn)一步損傷。這可能是天麻素對(duì)腦缺血損傷保護(hù)作用的另一重要途徑。但是具體天麻素如何作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制S100β在腦缺血再灌注早期的過(guò)表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。

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