張健昌 黃家園 黃 河 周嘉雯 暴 瓏 謝 敏 朱 銘 張艷翎 黎 黎 吳科鋒 李文德 黃 韌

(廣東醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，廣東 湛江 524023)

消旋卡多曲可用于成人、老人及兒童急性腹瀉的治療〔1～3〕，其在體內(nèi)迅速代謝為活性物質(zhì)硫芬(TP),TP通過抑制腦啡肽酶(NEP)活性，保護內(nèi)源性腦啡肽免受機體降解，延長消化道內(nèi)源性腦啡肽的生理活性，進而抑制水和電解質(zhì)的過度分泌來發(fā)揮其抗腹瀉作用〔4〕。TP可導(dǎo)致NEP活性降低，引起皮質(zhì)和腦脊液中的β-淀粉樣蛋白(Aβ)增多〔5～7〕，甚至可在海馬及其他大腦區(qū)域出現(xiàn)β-淀粉樣斑塊的沉積〔8～11〕。現(xiàn)有理論認(rèn)為Aβ是導(dǎo)致阿爾茨海默病(AD)發(fā)病的始動因素，Aβ更是AD的主要病理特征〔12〕。本研究探討消旋卡多曲對老年SD大鼠淀粉樣蛋白水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物和試劑 SPF級SD大鼠30只，雌雄各半，10月齡(由廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號：2009A034)，體重250 g±35 g。消旋卡多曲(山東鉑源化學(xué)有限公司)；鼠原性Aβ1～40、Aβ1～42、NEP ELISA試劑盒(美國RD公司)；Jk-6生物組織攤烤片機，JB-P5生物組織包埋機，生物組織脫水機(武漢俊杰電子有限公司)；轉(zhuǎn)輪切片機(德國萊卡有限公司)；尼康生物顯微鏡(日本尼康股份有限公司)。其余試劑均為分析純。

1.2消旋卡多曲供試液制備 消旋卡多曲100 g，置燒杯中，適量聚乙二醇400(PEG400)溶解，加蒸餾水配成含20% PEG 400的消旋卡多曲混懸液，標(biāo)示量為100 mg/ml母液，置4℃冰箱備用。

1.3實驗分組和處理 30只SD大鼠，隨機分為空白對照組、消旋卡多曲高劑量組(50 mg/kg)、消旋卡多曲低劑量組(100 mg/kg)每組10只。消旋卡多曲各劑量組，1次/d，灌胃給予相應(yīng)量的消旋卡多曲混懸液。空白對照組，1次/d，灌胃給予等量的20% PEG400溶液。28 d后，采血，置抗凝管，3 000 r/min，離心10 min，分離血漿。處死大鼠，快速取腦組織，左半球中性甲醛固定，右半球-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4ELISA法測定大腦及外周血中NEP及Aβ水平 取分離好的血漿及腦組織，按試劑盒說明書，加入相應(yīng)量的標(biāo)準(zhǔn)品及待測品各50 μl于反應(yīng)孔，并加入50 μl的生物素標(biāo)記的抗體。依次每孔加入60 μl的親和鏈霉素-HRP，底物A、B各50 μl。酶標(biāo)儀波長450 nm處測定各孔OD值。

1.5病理觀察海馬神經(jīng)元病理改變 取目標(biāo)組織修塊,置于包埋塑料盒,自來水沖洗24 h，后脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片，進行HE染色，置于40倍光鏡下觀察神經(jīng)元數(shù)目的改變、萎縮的情況，選相同的病變部位(海馬區(qū)CA3及齒狀回)連續(xù)照相。

2 結(jié) 果

2.1消旋卡多曲對血漿中Aβ1～40、Aβ1～42、NEP含量的影響 外周血中，消旋卡多曲各劑量組與空白對照組相比，Aβ1～40和Aβ1～42含量盡管稍有增加，但差異無顯著性(P>0.05)；亦無明顯降低NEP含量的跡象(P>0.05)，見表1。

表1 消旋卡多曲對大鼠血漿中Aβ1～40、Aβ1～42、NEP含量的影響(n=10，OD，±s)

2.2消旋卡多曲對腦組織中Aβ1～40、Aβ1～42、NEP含量的影響 與空白對照組相比，消旋卡多曲各劑量組均能明顯增加腦組織中Aβ1～40及Aβ1～42含量(P<0.05)，但組間差異不明顯，也有降低腦內(nèi)NEP含量的跡象，但僅高劑量組差異顯著(P<0.05)。見表2。

表2 消旋卡多曲對大鼠腦組織中Aβ1～40、Aβ1～42、NEP含量的影響(n=10，OD，±s)

2.3消旋卡多曲對大鼠腦中海馬組織的CA3區(qū)和齒狀回區(qū)的損傷情況 圖1可見，大鼠海馬CA3區(qū)，消旋卡多曲各組較空白對照組，鏡下可見明顯的神經(jīng)細胞胞體固縮，胞核深染，核仁不明顯，且高劑量組有明顯的神經(jīng)元萎縮。在海馬齒狀回區(qū)域可發(fā)現(xiàn)消旋卡多曲各組均出現(xiàn)局部顆粒細胞深染，核仁核膜分界不清的情況，神經(jīng)元細胞萎縮明顯，且高劑量組有明顯可見的神經(jīng)元細胞數(shù)量減少(見圖2)。

3 討 論

消旋卡多曲有研究〔13〕指出往人體內(nèi)靜脈輸注156 μg Acetorphan(與Racecadotril屬同一藥物)〔14〕后，顯示腦脊液內(nèi)的NEP活性下降大約65%。NEP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的生理功能，尤其在清除腦內(nèi)Aβ過程中起著重要作用，是Aβ降解的主要限速酶〔8，11〕，表明腦啡肽酶活性即使是部分降低也可以使Aβ升高乃至沉積，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生。

本實驗這說明消旋卡多曲引起了實驗對象大腦內(nèi)Aβ水平升高，與相關(guān)研究小組在其他實驗動物和本課題組在恒河猴腦內(nèi)直接注入Thiophan能夠引起皮層及基底核的神經(jīng)元內(nèi)淀粉樣蛋白增多以及海馬等部位神經(jīng)元損傷的結(jié)果相一致〔15，16〕。此外，病理檢查提示超量應(yīng)用消旋卡多曲可促使大腦Aβ表達水平增高，對神經(jīng)元造成損傷，海馬區(qū)尤甚，有增加AD發(fā)病風(fēng)險的可能。

文獻〔17，18〕調(diào)研發(fā)現(xiàn)，歐洲3～89歲的腹瀉患者口服消旋卡多曲發(fā)生的不良反應(yīng)以消化系統(tǒng)疾病為主，占68.82%，主要表現(xiàn)為便秘、嘔吐、腹脹、肝損害等，其中便秘發(fā)生率最高，神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)僅占10.22%，表現(xiàn)僅為頭暈、頭痛等癥狀，未見其他嚴(yán)重不良反應(yīng)，但絕大部分動物實驗結(jié)果顯示靜注或直接腦內(nèi)給藥，均導(dǎo)致β樣淀粉蛋白沉積及發(fā)生不同程度的神經(jīng)元細胞萎縮。消旋卡多曲在國內(nèi)僅批準(zhǔn)為用于兒童急性腹瀉，對于成人尤其是老年人的使用并無明令禁止。盡管尚無相關(guān)臨床資料指出消旋卡多曲能明顯增加AD發(fā)生的風(fēng)險，但結(jié)合本實驗及過往動物實驗研究的結(jié)果，該藥在老年人(尤其是AD患者)仍應(yīng)慎用，應(yīng)注意控制用藥劑量及時間。

4 參考文獻

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