李珊珊，李 翊，彭代銀，陳衛(wèi)東，韓 嵐，賈步云，王飛龍

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012)

正交試驗(yàn)法優(yōu)選桃紅四物湯的水提工藝

李珊珊，李 翊，彭代銀，陳衛(wèi)東，韓 嵐，賈步云，王飛龍

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012)

目的優(yōu)選桃紅四物湯的水提工藝。方法以芍藥苷和浸膏得率為考察指標(biāo)，以加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選桃紅四物湯的最佳水提工藝。結(jié)果桃紅四物湯的最佳水提工藝為加12倍量水提取3次，每次1.5 h。結(jié)論優(yōu)選出的桃紅四物湯的水提工藝合理，可為其工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

桃紅四物湯；水提工藝；正交試驗(yàn)；芍藥苷；浸膏得率

桃紅四物湯源自清代吳謙所著《醫(yī)宗金鑒·婦科心法要訣》，該方由桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎6味中藥所構(gòu)成，為傳統(tǒng)活血化瘀方劑之一，具有活血化瘀、養(yǎng)血補(bǔ)血之功效，為治療血虛血瘀證尤其是婦科血瘀證的常用經(jīng)典方劑[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯還具有抗血栓[2]，增加冠狀動(dòng)脈血液流量，改善血液流變性及微循環(huán)，降低血管通透性，降低血脂，增強(qiáng)免疫功能等方面的作用[3]。但是桃紅四物湯在臨床用藥上多以湯劑為主，存在服用、攜帶不便，穩(wěn)定性差，易霉變等缺點(diǎn)[4]，導(dǎo)致其在使用及推廣中受到限制。現(xiàn)擬將其改制成桃紅四物顆粒，既可保留湯劑吸收迅速、療效確切的特點(diǎn)，又可改善湯劑在應(yīng)用中的缺點(diǎn)，擴(kuò)大使用范圍，為以后的應(yīng)用與開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。為保證顆粒劑的質(zhì)量及療效，本研究根據(jù)組方藥物有效成分的理化性質(zhì)對(duì)桃紅四物湯的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。前期已對(duì)組方中桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎4味藥材的醇提工藝進(jìn)行了研究，其最佳醇提工藝為6倍量80%乙醇提取3次，每次1.5 h。本研究將對(duì)桃紅四物湯的水提工藝進(jìn)行研究，最終確定桃紅四物湯的提取工藝。

1 材料

1.1 藥物及試劑 桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎藥材均購(gòu)自安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，批號(hào)依次為130331、130406、130405、130625、130519、130519；芍藥苷對(duì)照品：批號(hào) 121402-201337；甲醇、乙腈為色譜純。

1.2 儀器 LC-15C型高效液相色譜儀、SPD-15C型紫外檢測(cè)器：日本島津；AB135-S型十萬(wàn)分之一分析天平、PL601-S型電子天平：瑞士梅特勒公司；SHB-Ⅲ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HH-S2型水浴鍋：江蘇省常州普天儀器制造有限公司；DZF-6050型真空干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DL-1型電爐：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 芍藥苷含量測(cè)定[5]

2.1.1 色譜條件：色譜柱為COSMOSIL C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；進(jìn)樣量為20 μL。依上述色譜方法進(jìn)樣。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備：取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成60 μg/mL溶液，即得。

圖1對(duì)照品(A)、供試品(B)和缺白芍陰性樣品(C)高效液相色譜圖

2.1.3 供試品溶液的制備：按處方比例稱取桃仁、當(dāng)歸各9 g，紅花、川芎各6 g，共9份，經(jīng)最佳醇提工藝提取后，藥渣與白芍9 g、熟地黃12 g合并，按水提正交L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)行水煎煮提取，濾液濃縮后置真空干燥箱干燥至恒質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率。取干浸膏粉適量，精密稱定，至50 mL容量瓶中，精密加入50%乙醇35 mL，超聲處理30 min，放冷，加50%乙醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：分別精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻后分別精密吸取20 μL進(jìn)樣，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=28 297x-1 763.2(r=0.999 6)，線性范圍為0.60～15.00 μg/mL。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn)：取一定濃度的芍藥苷對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，其RSD值為0.79%，表明該方法精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取同一樣品6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定峰面積，計(jì)算其芍藥苷含量，結(jié)果得RSD值為1.60%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取樣品適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h測(cè)定峰面積，計(jì)算芍藥苷含量，結(jié)果RSD值為0.67%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱取已知含量的同一樣品6份，采用加樣回收試驗(yàn)，分別加入1 mL芍藥苷對(duì)照品溶液(60 μg/mL)，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定芍藥苷含量，結(jié)果顯示平均加樣回收率為99.94%，RSD為0.96%，結(jié)果表明該方法回收率良好。

2.1.9 芍藥苷測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.2 浸膏得率測(cè)定 按水提正交試驗(yàn)提取后將藥液濾過(guò)，濾液濃縮，置已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后置真空干燥箱60 ℃干燥至恒質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率(浸膏得率=干浸膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%)。

2.3 水提正交試驗(yàn)

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：將經(jīng)醇提后的桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎與白芍、熟地黃按處方比例合并后采用水煎煮提取，以芍藥苷含量和浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)(浸膏得率和芍藥苷的權(quán)重系數(shù)分別為0.4、0.6)，以加水量(A)、提取次數(shù)(B)、提取時(shí)間(C)為因素，選取3個(gè)水平，按L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)選最佳的水提工藝條件，水提正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.3.2 水提正交試驗(yàn)結(jié)果：由直觀分析可得，對(duì)水提取效果的因素影響為B>C>A，最佳工藝的組合為A3B3C2。以空白項(xiàng)為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示B因素對(duì)水提工藝具有顯著性影響，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際與成本考慮，選擇水提取的最優(yōu)組合為A3B3C2，即12倍量水提取3次，每次1.5 h。見(jiàn)表2、表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

注：F0.05(2,2)=19。

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：按處方比例稱取桃仁、當(dāng)歸各9 g，紅花、川芎各6 g，共3份，按最優(yōu)醇提工藝提取后藥渣與白芍9 g、熟地黃12 g合并，按最佳水提工藝進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表4，顯示優(yōu)選的水提工藝穩(wěn)定、可靠。

表4 水提工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

桃紅四物湯是治療血虛血瘀證的常用方，原多用于治療婦科月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)等證，現(xiàn)代臨床將其廣泛用于全身各系統(tǒng)疾病的治療，療效顯著[6]。在桃紅四物湯提取工藝研究中，根據(jù)方中藥物有效成分的理化性質(zhì)，采取先醇提后水提的方式進(jìn)行提取，通過(guò)浸膏得率和含量測(cè)定進(jìn)行綜合評(píng)分優(yōu)選出的工藝更具有合理性和有效性。其中，在桃紅四物湯的水提工藝研究中，浸膏得率是工藝優(yōu)選中的傳統(tǒng)指標(biāo)，芍藥苷為白芍中的指標(biāo)性成分。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)法，得到桃紅四物湯的最佳水提工藝為12倍量水提取3次，每次1.5 h。采用多指標(biāo)綜合評(píng)分，能夠全面地評(píng)價(jià)桃紅四物湯的水提工藝，且方法簡(jiǎn)單、成本低廉、便于操作，為日后桃紅四物顆粒的研制和開(kāi)發(fā)提供了必要的基礎(chǔ)和保障。

[1]梁杰,尹登科,李白坤,等.桃紅四物湯對(duì)藥物致不完全流產(chǎn)早孕大鼠的血管生成及Ang-1,Ang-2,Tie-2表達(dá)的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2013,38(21):3731-3735.

[2]韓嵐,彭代銀,許釩,等.桃紅四物湯抗血栓形成作用研究[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,29(1):47-49.

[3]張正升,彭代銀.桃紅四物湯臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥,2011,15(9):1162-1165.

[4]王權(quán),吳德玲,黃金玲,等.多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)選苓桂術(shù)甘顆粒水提工藝[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,32(4):87-90.

[5]于定榮,顧雪竹,張村,等.白芍中芍藥苷提取工藝的對(duì)比研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(15):49-51.

[6]丁艷杰,張前德.桃紅四物湯臨床與實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].江蘇中醫(yī)藥,2010,42(1):77-79.

OptimizationofWaterExtractionProcessforTaohongSiwuDecoctionbyOrthogonalTest

LIShan-shan,LIYi,PENGDai-yin,CHENWei-dong,HANLan,JIABu-yun,WANGFei-long

(DepartmentofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

ObjectiveTo optimize the water extraction process for Taohong Siwu Decoction.MethodsWith paeoniflorin content and extract yield as indices, the orthogonal test was adopted to determine the optimal water amount, extraction time, and extraction times in the water extraction process for Taohong Siwu Decoction.ResultsIn the optimal process, extraction was performed 3 times (1.5 h each) using water (12 times).ConclusionThe optimized water extraction process is reasonable and feasible, which can provide a reference for the industrial production of Taohong Siwu Decoction.

Taohong Siwu Decoction;water extraction process;orthogonal test;paeoniflorin;extract yield

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81073091)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1408085QH163)

李珊珊(1990-)，女，碩士研究生

彭代銀，pengdy@ahtcm.edu.cn

R283

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.021

2014-06-20)