王 飛，劉國夫，陳 蒙，左 建，楊 曄

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012)

載黃芪多糖組織工程支架促糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)研究

王 飛，劉國夫，陳 蒙，左 建，楊 曄

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012)

目的研究載黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)組織工程支架(APS/PDLGA)對糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響。方法采用高壓靜電紡絲技術(shù)制備APS/PDLGA超細纖維，構(gòu)成三維纖維網(wǎng)狀組織工程支架；掃描電子顯微鏡觀察纖維形貌，并計算直徑；采用苯酚-濃硫酸法檢測載藥量與包封率；將APS/PDLGA用于糖尿病大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面修復(fù)，采用蘇木精-伊紅染色觀察各實驗組皮膚修復(fù)進程。結(jié)果APS/PDLGA纖維表面光滑、粗細均勻、直徑(2.56±0.50)μm、載藥量(5.22±0.076)%、包封率(90.06±1.31)%，覆蓋APS/PDLGA纖維膜組的糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面約在第18天完全愈合，新生上皮外觀與結(jié)構(gòu)和正常皮膚相似，愈合速度明顯快于空白PDLGA纖維膜組和對照組創(chuàng)面(P<0.01)。結(jié)論APS/PDLGA纖維組織工程支架可促進糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合，有望應(yīng)用于糖尿病皮膚潰瘍治療。

高壓靜電紡絲；載黃芪多糖組織工程支架；糖尿病大鼠；皮膚創(chuàng)面愈合

糖尿病難愈性潰瘍是由糖尿病微血管病變與神經(jīng)病變所引起的常見糖尿病并發(fā)癥之一。據(jù)WHO最新統(tǒng)計,中國糖尿病患者已達9 240萬，約超過15%的糖尿病患者發(fā)生足潰瘍，80%的糖尿病患者會因足潰瘍而導(dǎo)致截肢，給患者帶來巨大的傷害[1-3]。自體皮膚移植在糖尿病皮膚潰瘍的治療中取得了很大的成功，但是新增手術(shù)創(chuàng)傷以及自體皮膚來源不足限制了其在臨床上的應(yīng)用[4]。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，研發(fā)治療糖尿病皮膚潰瘍的組織工程支架成為關(guān)注焦點。近年發(fā)展起來的高壓靜電紡絲技術(shù)可用于聚合納米纖維的制備，它不但能夠直接利用多種天然或合成高分子材料，而且可以在制備過程中負載多種生物活性物質(zhì)，獲得的三維纖維網(wǎng)具有高比表面積、高孔隙率的特點，經(jīng)大量實驗證實可模擬細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，為細胞生長提供與機體類似的生長微環(huán)境[5-6]。借此優(yōu)勢，靜電紡絲技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域中。

黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)是中藥黃芪的主要活性成分。研究發(fā)現(xiàn)，APS通過促進一氧化氮生成加快內(nèi)皮細胞增殖、遷移與管腔生產(chǎn)，進而促進血管新生，對糖尿病血管并發(fā)癥有明確的治療作用[7]。本研究通過高壓靜電紡絲技術(shù)將APS負載于可降解聚合物聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(D,L-lactide-co-glycolide)，PDLGA)纖維中，構(gòu)建載APS的三維纖維網(wǎng)狀組織工程支架APS/PDLGA，并考察其對糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)作用。

1 材料

1.1 主要藥品與試劑 黃芪多糖(純度：80.6%)：本實驗室自行提取[8]；PDLGA(62 kDa)：浙江普洛家園生物醫(yī)學(xué)材料有限公司，批號 Y10080911002；天狼星紅、鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)：美國Sigma公司，批號分別為2829438、18883664；蘇木精染色液、伊紅染液、中性樹膠：廣州市欣源貿(mào)易有限公司，批號分別為474077、C0109、20110930。

1.2 儀器與設(shè)備 DW-P303-1ACF0型高壓直流電源：天津市東文高壓電源廠；LSP01-1A型微量注射泵：保定蘭格恒流有限公司；DZF-200型真空干燥箱：上海浦東躍新科學(xué)儀器廠；DF-101B型恒溫磁力攪拌器：河南省鞏義市英峪予華儀器廠；UV757CRT型紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器廠；Quanta200型掃描電子顯微鏡：日本生產(chǎn)；血糖測試儀：長沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司。

1.3 動物 SD大鼠，雄性，3月齡，體質(zhì)量200～250 g。安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011-002。

2 方法

2.1 高壓靜電紡纖維制備 精密稱取0.198 7 g PDLGA溶于2.00 mL二氯甲烷，配制質(zhì)量分數(shù)為7%的PDLGA溶液。精密稱取1.028 0 g APS粉末溶于5.00 mL蒸餾水，配制0.205 6 g/mL APS溶液，加入少量羧甲基纖維素鈉作為乳化劑，精密移取60 μl，高速攪拌過程中緩慢滴加至PDLGA溶液中，攪拌30 min，得載藥油包水乳液。將乳液倒入2 mL注射器中，采用削平的9號注射針頭作為噴嘴，注射泵連接高壓直流電源的正極，鋁箔接收板連接其負極，在噴嘴與收集板間距離18 cm、電壓15 kV、流速1.0 mL/h條件下接收載APS纖維APS/PDLGA。以相同實驗參數(shù)制備不含APS油包水乳液，并以上述同樣方法與實驗參數(shù)制備并接收空白PDLGA纖維。以真空干燥箱去除纖維中殘留溶劑，4 ℃干燥條件下保存。

2.2 纖維形貌表征 取少量空白PDLGA與APS/PDLGA纖維膜，固定于銅靶，噴金，掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察纖維膜形貌并拍照，隨機選取3張同一倍數(shù)下纖維圖片，以Adobe Photoshop CS3軟件分別測量每根纖維直徑，計算平均值。

2.3 APS/PDLGA纖維載藥量、包封率測定 稱取APS粉末4.0 mg 溶于10.00 mL蒸餾水，配制濃度0.4 mg/mL APS溶液。精密移取此溶液0.00、0.02、0.04、0.10、0.20、0.40、1.00、2.00 mL，加蒸餾水補足至2.00 mL，加入5%苯酚溶液1 mL、濃硫酸4 mL，水浴加熱15 min，于紫外可見分光光度計490 nm處測定吸光度值，繪制APS濃度測定標準曲線。

稱取15 mg APS/PDLGA纖維膜，加入0.50 mL二氯甲烷至完全溶解，以2.00 mL蒸餾水反復(fù)萃取APS 3～5次，靜置，取上清液，以上述苯酚-濃硫酸法測定纖維中APS含量，根據(jù)下列公式計算APS/PDLGA纖維載藥量與包封率，實驗平行進行3次。

載藥量=(載藥纖維膜中APS的質(zhì)量/載藥纖維膜的質(zhì)量)×100%。

包封率=(載藥纖維膜中APS的質(zhì)量/APS投藥量)×100%。

2.4 APS/PDLGA纖維膜對糖尿病皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)作用評價

2.4.1 糖尿病皮膚創(chuàng)傷模型復(fù)制：大鼠18只，隨機平均分為6組，每組各3只，禁食12 h 后，以45 mg/kg濃度腹腔注射2% STZ檸檬酸鈉緩沖液(pH值=4.0)，3 d后測定血糖濃度，如測定結(jié)果高于16.7 mmol/L則糖尿病模型復(fù)制成功，如低于16.7 mmol/L繼續(xù)追加STZ。參考張臻等[9]糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)傷模型的復(fù)制方法，以300 mg/kg劑量注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，8% Na2S褪去大鼠背部毛發(fā)，在背脊柱部去除3個直徑約1.8 cm的圓形區(qū)域的全層皮膚。精密稱取空白PDLGA與APS/PDLGA纖維膜各10.0 mg，分別覆蓋于創(chuàng)面，以不做處理創(chuàng)面作為對照組。各組創(chuàng)面用紗布覆蓋并以3號線固定紗布防止纖維膜脫落，為避免大鼠間相互舔舐傷口及抓撓紗布，手術(shù)后均單籠飼養(yǎng)。見圖1。

注：A.大鼠去除背部全層皮膚模型圖；B.創(chuàng)面縫合圖

圖1糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面模型

2.4.2 創(chuàng)面愈合觀察：創(chuàng)面處理后，觀察不同時間點(3、6、9、12、15、18 d)各組皮膚的愈合情況，對各組創(chuàng)面進行拍照，并計算各組創(chuàng)面在不同時間點愈合率[10]。

2.4.3 蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色：取糖尿病大鼠術(shù)后各時間點各實驗組創(chuàng)面新生組織，冰凍切片，多聚甲醛固定后，作常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 纖維形貌表征 空白PDLGA纖維與APS/PDLGA纖維表面光滑，粗細均勻，無液滴、黏連及分叉現(xiàn)象，直徑分別為(2.52±0.60)μm與(2.56±0.50)μm，兩組纖維直徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

注：A.空白PDLGA纖維；B.APS/PDLGA纖維。

圖2空白PDLGA與APS/PDLGA纖維的SEM圖片(5 000倍)

3.2 APS/PDLGA纖維載藥量與包封率 APS/PDLGA纖維載藥量為(5.22±0.076)%，與理論載藥量相近；包封率為(90.06±1.31)%。李沉紋等[11]利用靜電紡絲技術(shù)于不同參數(shù)下制備載藥聚乙烯醇-海藻酸鈉納米纖維，藥物包封率多在65%左右，而本研究中藥物包封率遠高于該報道，分析這是由于本研究將藥物溶液分散于纖維基質(zhì)材料聚合物溶液中形成穩(wěn)定的油包水乳液，高壓靜電紡絲過程中藥物損失較少。

3.3 創(chuàng)面愈合情況觀察 糖尿病大鼠背部皮膚創(chuàng)面愈合率顯示，術(shù)后第6、12與18天覆蓋APS/PDLGA纖維膜組創(chuàng)面各個時間點的愈合率均顯著高于其他各組(P<0.01)。術(shù)后第6天，可見多數(shù)實驗組創(chuàng)面的紗布因傷口結(jié)痂收縮而自動掉落或被大鼠抓除，APS/PDLGA纖維膜組創(chuàng)面已有大面積愈合，創(chuàng)面中心處基底充血，大量肉芽組織增生，愈合處新生皮膚較薄，無感染情況；空白PDLGA纖維膜組創(chuàng)面結(jié)痂，愈合面積明顯小于APS/PDLGA纖維膜組；對照組創(chuàng)面有明顯的炎癥現(xiàn)象，且未愈合面積較大。術(shù)后12 d，APS/PDLGA纖維膜組創(chuàng)面愈合面積達(92.42±1.85)%，僅中心處有小部分創(chuàng)面未愈合，新生皮膚有少許毛發(fā)生長；空白PDLGA纖維膜組和對照組未愈合面積超過1/4。術(shù)后18 d，APS/PDLGA纖維膜組創(chuàng)面已幾乎完全愈合，新生皮膚表面光滑、色澤較好，毛發(fā)生長明顯增多；空白PDLGA纖維膜組和對照組仍有約1/5創(chuàng)傷面積未愈合。說明覆蓋于糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的APS/PDLGA纖維膜，不但可以保護創(chuàng)傷部位免于感染，并可通過持續(xù)釋放APS，對糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面與創(chuàng)周組織內(nèi)皮細胞功能與結(jié)構(gòu)的改善起到積極的作用，促進創(chuàng)面微血管重建，從而有效地促進傷口愈合。見圖3。

圖3 術(shù)后6、12、18 d糖尿病大鼠各組皮膚創(chuàng)面愈合情況(A. 愈合狀況圖；B. 創(chuàng)面愈合率;n=3)

3.4 HE染色結(jié)果 術(shù)后6 d，APS/PDLGA纖維膜組出現(xiàn)明顯的修復(fù)跡象，創(chuàng)面被大量纖維細胞填充，有明顯微血管形成，無聚合物纖維殘留，有大量膠原分泌；空白PDLGA纖維膜組創(chuàng)面有修復(fù)現(xiàn)象，但膠原分泌量較少，組織結(jié)構(gòu)松散，仍有零星未完全降解聚合物纖維存在；對照組創(chuàng)面無明顯修復(fù)跡象，細胞數(shù)稀少，創(chuàng)面填充物多為炎性滲出物。術(shù)后18 d，APS/PDLGA纖維膜組創(chuàng)面新生皮膚真皮層由大量膠原纖維與少量的成纖維細胞填充，可觀察到明顯的處于分化階段的皮膚附屬器，表皮層結(jié)構(gòu)與正常皮膚表皮結(jié)構(gòu)相似；空白PDLGA纖維膜組新生皮膚組織中聚合物纖維完全降解，表皮和真皮層均仍處于修復(fù)過程，新生真皮層有大量膠原纖維分泌但結(jié)構(gòu)松散，表皮層結(jié)構(gòu)分化不完全；對照組創(chuàng)面新生皮膚真皮層仍有大量纖維細胞，僅有少量膠原纖維存在，表皮層較厚且分化不完全。HE染色結(jié)果說明，APS/PDLGA纖維膜在應(yīng)用于糖尿病皮膚創(chuàng)面的修復(fù)過程中，一方面通過其三維纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為細胞生長提供力學(xué)支撐，加速肉芽組織生成，另一方面通過不斷釋放具有促血管新生作用的APS，促進創(chuàng)周組織中血管內(nèi)皮細胞的分裂、增殖、分化以及向創(chuàng)面遷移，并改善創(chuàng)周的血管功能，進而促進皮膚創(chuàng)面的愈合。見圖4。

圖4 各組糖尿病大鼠術(shù)后6、18 d創(chuàng)面新生組織(HE染色，10×20倍，紅色箭頭示新生微血管)

4 結(jié)論

皮膚組織工程產(chǎn)品是目前治療皮膚缺損的研究熱點。筆者針對糖尿病皮膚潰瘍發(fā)生與不愈的病機，結(jié)合APS的藥理作用，通過高壓靜電紡絲技術(shù)制備攜載APS聚合物纖維，構(gòu)成功能化三維纖維網(wǎng)狀組織工程支架APS/PDLGA，嘗試應(yīng)用于糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)傷的治療。載APS聚合物纖維形貌良好，載藥量及包封率與理論值接近；糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)傷治療的實驗證明，APS/PDLGA纖維膜可以通過APS的持續(xù)釋放與纖維膜的類細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，提高糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)傷的愈合速度。本研究可為開拓糖尿病皮膚潰瘍的治療新技術(shù)提供理論與實驗基礎(chǔ)。

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PromotiveEffectofAstragalusPolysaccharides-LoadedTissueEngineeringScaffoldsonSkinWoundHealinginDiabeticRats

WANGFei,LIUGuo-fu,CHENMeng,ZUOJian,YANGYe

(DepartmentofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

ObjectiveTo study the effect of Astragalus polysaccharides (APS)-loaded tissue engineering scaffolds composed of poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PDLGA) on the skin wound healing in diabetic rats.MethodsElectrospinning was used to prepare APS/PDLGA ultrafine fibers and form a three-dimensional fibrous reticular tissue engineering scaffold. The morphology of APS-loaded PDLGA fibers was observed under a scanning electron microscope (SEM), and the diameter of each fiber was calculated. Drug loading rate and encapsulation efficiency were measured by phenol-sulphate colorimetry. The APS/PDLGA scaffolds were used to treat skin ulcer wounds in some diabetic rats; the other rats were treated with blank PDLGA fibrous membrane or not treated to allow natural healing. The skin wound healing was observed by hematoxylin and eosin staining.ResultsSEM images showed that the APS/PDLGA fibers were smooth and had a uniform thickness, with a diameter of (2.56±0.50)μm, a drug loading rate of (5.22±0.076)%, and an encapsulation efficiency of (90.06±1.31)%. The skin wounds of rats in the APS/PDLGA group completely healed approximately on day 18, and the newly formed skin had similar appearance and structure as the normal skin; wound healing was significantly faster in the APS/PDLGA group than in the blank PDLGA group and natural healing group (P<0.01).ConclusionAPS/PDLGA tissue engineering scaffolds can promote skin wound healing in diabetic rats and hold promise for application in treatment of diabetic skin healing.

electrospinning; Astragalus polysaccharides-loaded tissue engineering scaffold; diabetic rat; skin wound healing

安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研創(chuàng)新項目(20120107)

王飛(1989-)，男，碩士研究生

楊曄，gnayye@126.com

R944

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.018

2014-03-09)