金海林 韓樹堂 曾楷峰 肖 斌 張偉鋒 施瑞華*

江蘇省中醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心1(210029) 江蘇省人民醫(yī)院消化科2

血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)是近年腫瘤研究領(lǐng)域提出的新概念。與經(jīng)典內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的血管不同，VM是由細(xì)胞外基質(zhì)和腫瘤細(xì)胞包繞紅細(xì)胞構(gòu)成的血管狀結(jié)構(gòu)。目前已發(fā)現(xiàn)VM存在于惡性黑色素瘤、骨肉瘤、舌鱗狀細(xì)胞癌、膽囊癌等多種惡性腫瘤中[1-4]。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor, HIF)-1α是HIF-1的α亞單位，通過感受微環(huán)境缺氧對缺氧誘導(dǎo)基因表達(dá)進行調(diào)節(jié)，維持機體對缺氧的適應(yīng)能力。堯良清等[5]發(fā)現(xiàn)西羅莫司可通過抑制HIF-1α mRNA表達(dá)而阻斷VM的形成。本實驗通過檢測食管鱗癌VM中HIF-1α的表達(dá)以及VM相關(guān)基因的表達(dá)，旨在探討HIF-1α在食管鱗癌VM中的作用及其可能的途徑。

材料與方法

一、細(xì)胞、主要試劑

人胚腎細(xì)胞293T、人食管鱗癌細(xì)胞株Eca109和TE13、惡性黑色素瘤細(xì)胞A375均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。

環(huán)形質(zhì)粒pGC-H1-GFP(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)，感受態(tài)大腸桿菌TOP10(南京博爾迪生物科技有限公司)，限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、HindⅢ和T4DNA連接酶(Fermantas)，胎牛血清和DMEM(Hyclone)，LipofectamineTM2000(Invitrogen)，克隆環(huán)(Sigma)，小鼠抗人HIF-1α、層黏連蛋白(LN)5γ2單克隆抗體(Chemicon)，小鼠抗人VE-cadherin、EphA2單克隆抗體(R&D)，兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2單克隆抗體(Abcam)，鼠抗人α-tubulin單克隆抗體(Sigma)，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(Rockland)，BCA蛋白定量、化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce)，Matrigel(BD)，Transwell小室(Corning)。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：所有細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，或于37 ℃、1% O2(5% CO2、94% N2)的缺氧條件下培養(yǎng)12 h。

2. 質(zhì)粒構(gòu)建：按HIF-1α基因序列(NM001530)設(shè)計合成3對HIF-1α-siRNA寡核苷酸片段，1號靶正義序列：5’-GAT CCC GAG GAA GAA CTA TGA ACA TAA TTC AAG AGA TTA TGT TCA TAG TTC TTC CTC TTT TTG GAT-3’，反義：5’-AGC TAT CCA AAA AGA GGA AGA ACT ATG AAC ATA ATC TCT TGA ATT ATG TTC ATA GTT CTT CCT CGG-3’；2號靶正義：5’-GAT CCC GCA CAG GCC ACA TTC ACG TAT ATT CAA GAG ATA TAC GTG AAT GTG GCC TGT GCT TTT TGG AT-3’，反義：5’-AGC TAT CCA AAA AGC ACA GGC CAC ATT CAC GTA TAT CTC TTG AAT ATA CGT GAA TGT GGC CTG TGC GG-3’；3號靶正義：5’-GAT CCC GAC TGA TGA CCA GCA ACT TGA TTC AAG AGA TCA AGT TGC TGG TCA TCA GTC TTT TTG GAT-3’，反義：5’-AGC TAT CCA AAA AGA CTG ATG ACC AGC AAC TTG ATC TCT TGA ATC AAG TTG CTG GTC ATC AGT CGG-3’。每對寡核苷酸兩端分別帶有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位點。將3對正義和反義siRNA寡核苷酸片段各1 μL與48 μL退火緩沖液混合；90 ℃溫育4 min，70 ℃溫育10 min。緩慢冷卻至10 ℃。用HindⅢ和BamHⅠ限制酶將1 μL pGCsi載體線性化。將2 μL退火后的siRNA寡核苷酸片段加入T4DNA連接酶緩沖液，再加1 μL pGCsi載體、5 μL DEPC水、1 μL T4DNA連接酶，室溫過夜，構(gòu)建的質(zhì)粒分別命名為pGCsi-HIF1、pGCsi-HIF2和pGCsi-HIF3。將重組質(zhì)粒和空載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌，在含氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)過夜后挑選單克隆，接種至LB液體培養(yǎng)基，振搖培養(yǎng)過夜，次日行質(zhì)粒純化抽提，測定濃度后-20 ℃保存。部分質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

3. 瞬時轉(zhuǎn)染：將293T細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染組、pGCsi-HIF1組、pGCsi-HIF2組、pGCsi-HIF3組和空載體組。轉(zhuǎn)染前1 d取對數(shù)生長期293T細(xì)胞2.5×105個接種于35 mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)于不含抗菌藥物的DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，次日觀察細(xì)胞生長至約90%聚合時開始轉(zhuǎn)染。取質(zhì)粒4 μg和10 μL LipofectamineTM2000稀釋于不含抗菌藥物的DMEM，室溫孵育20 min后加入培養(yǎng)皿，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，6 h后更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。分別于48、72 h收集細(xì)胞，篩選用于后續(xù)實驗的質(zhì)粒。

4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：Eca109和TE13細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染步驟與293T細(xì)胞相同。轉(zhuǎn)染后24 h按1∶12的比例傳代，48 h后分別用含800、400 mg/L的G418選擇性培養(yǎng)液進行篩選，約4周后挑取克隆在G418選擇性培養(yǎng)液中繼續(xù)傳代，擴大培養(yǎng)。以轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的細(xì)胞作為陰性對照，以培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的細(xì)胞作為空白對照。各組細(xì)胞分別命名為Eca109/siHIF、Eca109/Neo、Eca109、TE13/siHIF、TE13/Neo和TE13。

5. 三維培養(yǎng)：24孔培養(yǎng)板每孔加入300 μL Matrigel原液(冰浴上進行)，37 ℃培養(yǎng)30 min，每孔添加1 mL 5×105/mL各組細(xì)胞懸液(以黑色素瘤A375細(xì)胞為陽性對照)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，觀察食管癌細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)排列情況和完整程度。隨機于倒置顯微鏡下(×200)取上、下、左、右、中心5個視野，計數(shù)管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量，取均值，實驗重復(fù)三次。

6. 蛋白質(zhì)印跡法：提取各組細(xì)胞蛋白，BCA法定量，取總蛋白40 μg加熱變性后上樣，行40 mA穩(wěn)流SDS-PAGE電泳，100 V穩(wěn)壓冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后TBST漂洗5 min×3次，加入一抗(HIF-1α 1∶500，VE-cadherin 1∶500，EphA2 1∶500，LN5γ2 1∶200，MMP2 1∶2 000)4 ℃孵育過夜。次日TBST漂洗后，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗，ECL法顯影。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、pGCsi-HIF重組質(zhì)粒的鑒定

測序結(jié)果證實插入的shRNA序列與設(shè)計序列100%相符(見圖1)。

二、蛋白質(zhì)印跡法鑒定質(zhì)粒的干擾效果

與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，分別轉(zhuǎn)染pGCsi-HIF2和pGCsi-HIF3質(zhì)粒的293T細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)均下降，其中轉(zhuǎn)染pGCsi-HIF3質(zhì)粒72 h后的293T細(xì)胞蛋白表達(dá)最低，而僅轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)無明顯差異(見圖2)。因此，后續(xù)實驗使用pGCsi-HIF3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞。

三、RNA干擾對食管鱗癌細(xì)胞HIF-1α的沉默效果

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGCsi-HIF3質(zhì)粒后，Eca109/siHIF和TE13/siHIF細(xì)胞在熒光顯微鏡下均可見綠色熒光(見圖3)，表明細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒中綠色熒光蛋白。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明Eca109/siHIF和TE13/siHIF細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)均受到顯著抑制，與兩組對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖4)。

四、沉默HIF-1α抑制食管鱗癌VM形成

與A375細(xì)胞相似，Eca109和TE13細(xì)胞在Matrigel上均能模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞的特性并相互連接，約12 h后形成血管網(wǎng)狀樣結(jié)構(gòu)，呈單個環(huán)狀或多個環(huán)相連的網(wǎng)格狀，轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的細(xì)胞亦有相似表現(xiàn)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞體外管道形成能力受到顯著抑制，環(huán)狀結(jié)構(gòu)斷裂，管狀結(jié)構(gòu)數(shù)目明顯少于兩組對照組(P<0.05)(見圖5)。

A：pGCsi-HIF1；B：pGCsi-HIF2；C：pGCsi-HIF3

1 Da=0.9921 u

A：Eca109/siHIF；B：TE13/siHIF

1：Eca109；2：Eca109/Neo；3：Eca109/siHIF；4：TE13；5：TE13/Neo；6：TE13/siHIF

五、VM相關(guān)基因的表達(dá)

常氧下Eca109/siHIF和TE13/siHIF細(xì)胞中HIF-1α、VE-cadherin、EphA2、LN5γ2表達(dá)均被顯著抑制，與兩組對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而MMP2表達(dá)無明顯變化。缺氧條件下，未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組細(xì)胞中HIF-1α、VE-cadherin、EphA2、LN5γ2表達(dá)較常氧下明顯增強(P<0.05)，而MMP2表達(dá)無明顯差異(P>0.05)；缺氧培養(yǎng)后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HIF-1α、VE-cadherin、EphA2、LN5γ2、

MMP2表達(dá)與常氧培養(yǎng)相比并無明顯增加(P>0.05)(見圖6)。

*與相應(yīng)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較，P<0.05

討 論

1999年Maniotis等[1]對侵襲性黑色素瘤的研究發(fā)現(xiàn)了一種由腫瘤細(xì)胞包繞而無內(nèi)皮細(xì)胞被覆、由PAS染色陽性的細(xì)胞外基質(zhì)間隔的管腔，并將這種微循環(huán)結(jié)構(gòu)稱為VM，VM為腫瘤提供了一種新的血液供應(yīng)方式和途徑。進一步研究發(fā)現(xiàn)VM傾向存在于高度惡性的腫瘤組織中[6]，且VM往往預(yù)示多種腫瘤患者的預(yù)后不良[4,7-11]。VM的分子機制目前已形成了相關(guān)假說，然而，確切的機制及其所依賴的關(guān)鍵信號通路尚未達(dá)成一致。

圖6 蛋白質(zhì)印跡法檢測兩株食管鱗癌細(xì)胞中HIF-1α、EphA2、VE-cadherin、MMP2和LN5γ2的表達(dá)

Sun等[12]利用惡性黑色素瘤細(xì)胞B16接種后肢股動脈結(jié)扎的7周齡C57小鼠和未結(jié)扎小鼠， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)扎小鼠腫瘤組織VM數(shù)量明顯多于對照組，且與HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)，與MMP2、MMP9和VEGF表達(dá)不相關(guān)，提示腫瘤組織VM的形成與局部缺血缺氧微環(huán)境相關(guān)。本研究中，構(gòu)建特異性針對HIF-1α的shRNA質(zhì)粒后瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡法顯示pGCsi-HIF3質(zhì)粒的干擾效果最強。隨后將該質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩株高度惡性食管鱗癌細(xì)胞株Eca109和TE13，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果示獲得的單克隆干擾效果滿意。由于VM最早在惡性黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)，故常將其作為陽性對照。本研究基于Matrigel的體外三維培養(yǎng)實驗亦以惡性黑色素瘤細(xì)胞A375為陽性對照，結(jié)果表明與A375細(xì)胞相似，兩株食管鱗癌細(xì)胞均可形成血管網(wǎng)狀樣結(jié)構(gòu)，而穩(wěn)定干擾組細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)的能力被顯著抑制。提示高度惡性食管鱗癌中存在VM，且HIF-1α對VM的發(fā)生有重要作用，與Sun等[12]的研究結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)VM的形成與VE-cadherin、EphA2、LN5γ2和MMP2等表達(dá)密切相關(guān)[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α表達(dá)沉默后，兩株食管鱗癌細(xì)胞中VE-cadherin、EphA2表達(dá)受到明顯抑制，而MMP2表達(dá)無明顯變化；Eca109/siHIF細(xì)胞中LN5γ2表達(dá)完全沉默，而TE13/siHIF細(xì)胞中尚可見少量表達(dá)，但顯著低于對照組，這個差異可能與不同細(xì)胞株之間的差異有關(guān)。缺氧條件下兩株食管鱗癌細(xì)胞中VE-cadherin、EphA2、LN5γ2表達(dá)較常氧條件下明顯增加，而MMP2表達(dá)無明顯差異。提示VE-cadherin、EphA2、LN5γ2中可能存在HIF-1α的靶基因，而MMP2與HIF-1α無明顯關(guān)系。

最新研究發(fā)現(xiàn)僅以靶向經(jīng)典血管的藥物治療并不能完全阻斷腫瘤細(xì)胞的血供[15]，而聯(lián)合靶向VM的藥物能取得更好的療效。因此VM的研究對腫瘤治療極具臨床價值。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在食管鱗癌VM形成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中有重要作用，其機制可能是通過直接或間接調(diào)節(jié)VE-cadherin、EphA2、LN5γ2表達(dá)而發(fā)揮作用，使腫瘤在缺氧微環(huán)境中獲取營養(yǎng)。然而，HIF-1α在食管鱗癌中調(diào)控VM發(fā)生、發(fā)展的確切機制和信號通路有待進一步深入研究。

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