吳小琴 曾志榮 許麗霞 曹清華 陳 斌 陳旻湖 胡品津

廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化科1(510260) 中山大學附屬第一醫(yī)院消化科2 病理科3

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類生命。炎癥與癌癥關系密切，被列為癌癥的第七大特征[1]，而白細胞介素-17A(IL-17A)可能參與了炎癥相關腫瘤的形成。本課題組前期研究[2]發(fā)現(xiàn)，IL-17A G197A多態(tài)性與某些亞型胃癌的發(fā)生風險增加有關。本研究通過分析IL-17A在胃癌組織中的表達，并探討體外IL-17A處理對胃癌細胞增殖、凋亡及其下游腫瘤相關炎性因子表達的影響，以期進一步了解IL-17A與胃癌的關系。

材料與方法

一、標本獲取

選取2004年7月～2005年6月于中山大學附屬第一醫(yī)院行胃癌根治術的54例胃癌患者的癌組織和16例相應癌旁非癌組織(距離癌灶邊緣>3 cm)，所有標本均經(jīng)HE染色病理檢查明確診斷。入選患者男33例，女21例，年齡41～72歲，平均(56.7±12.6)歲。所有患者手術前均未接受過放、化療。

二、細胞株、主要試劑

胃癌細胞株AGS、SGC7901、MKN45、MKN87、SUN1、SUN16購自美國ATCC公司，傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中(37 ℃，5%CO2)；山羊抗人IL-17A多克隆抗體、重組人IL-17A蛋白購自美國R&D公司；細胞總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；RT-PCR和real-time PCR試劑盒購自日本TOYOBO公司；MTT和Annexin V-FITC試劑盒購自廣州展晨生物科技有限公司。

三、方法

1. 免疫組化法檢測IL-17A表達：以免疫組化SP法檢測胃癌組織和相應癌旁非癌組織中的IL-17A表達和分布。組織切片脫蠟、水化，3% H2O2室溫封閉5～10 min，蒸餾水洗滌3次，置于10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液中加熱20 min，PBS沖洗后加入山羊抗人IL-17A多克隆抗體(1∶400)，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗后加入二抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染、脫水、中性樹膠封固后于光學顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。IL-17A免疫組化染色陽性細胞胞質呈棕褐色。參考Zhang等[3]采用的方法，每例標本選取5個視野(×400)計數(shù)陽性細胞，結果取均值。

2. RT-PCR法檢測IL-17A mRNA表達：取對數(shù)生長期胃癌細胞株AGS、SGC7901、MKN45、MKN87、SUN1、SUN16，以炎癥性腸病患者外周血單核細胞作為陽性對照，參照細胞總RNA提取試劑盒和RT-PCR試劑盒說明書進行操作。IL-17A引物上游：5’-ACT CCT GGG AAG ACC TCA TTG-3’，下游：5’-GGC CAC ATG GTG GAC AAT CG-3’；GAPDH 引物上游：5’-TGG TCT CCT CTG ACT TCA AC-3’，下游：5’-GTG AGG GTC TCT CTC TTC CT-3’。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，上UVP GDS-7600 凝膠圖像成像系統(tǒng)檢測。

3. 細胞增殖檢測：取對數(shù)生長期SGC7901細胞制成單細胞懸液，以9×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)4～6 h后，分別加入不同濃度(10、50、100 ng/mL)重組人IL-17A，對照組加入等體積DMSO，培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄上清液，加入DMSO 200 μL，低速振蕩10 min，以酶標儀測定492 nm波長處各孔吸光度(A)值。細胞增殖率=實驗孔A值/對照孔A值×100%。實驗重復3次，結果取均值。

4. 細胞凋亡檢測：取對數(shù)生長期SGC7901細胞，以5×104/孔接種于6孔板，加入含0.25 mmol/L H2O2的無血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，PBS沖洗2次，換為含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，并加入不同濃度(0、10、100 ng/mL)重組人IL-17A，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，按Annexin V-FITC試劑盒說明書行細胞染色，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

5. real-time RT-PCR法檢測IL-6、基質金屬蛋白酶-13(MMP-13) mRNA表達：取對數(shù)生長期SGC7901細胞接種于6孔板，待細胞完全貼壁后，換為含不同濃度(0、10、100 ng/mL)重組人IL-17A的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h后收集細胞，參照細胞總RNA提取試劑盒和real-time PCR試劑盒說明書進行操作。IL-6引物上游：5’-TGT AGC CGC CCC ACA CA-3’，下游：5’-GGA TGT ACC GAA TTT GTT TGT CAA-3’；MMP-13引物上游：5’-GAA TTA AGG AGC ATG GCG ACT T-3’，下游：5’-CCC AGG AGG AAA AGC ATG AG-3’；β-actin引物上游：5’-GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT-3’，下游：5’-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3’。PCR反應條件：93 ℃ 3 min；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、IL-17A在胃癌和癌旁非癌組織中的表達

免疫組化染色結果顯示，IL-17A陽性染色主要定位于細胞質，呈棕褐色顆粒樣，細胞核無陽性染色。胃癌組織中IL-17A呈散在分布，主要表達于炎性細胞和血管內皮細胞；相應癌旁非癌組織有少量炎性細胞表達IL-17A。胃癌組織中IL-17A陽性細胞數(shù)較相應癌旁非癌組織顯著增多(P=0.007)(見圖1)。

二、IL-17A在胃癌細胞株中的表達

RT-PCR法檢測結果顯示，胃癌細胞株AGS、SGC7901、MKN45、MKN87、SUN1、SUN16中均無IL-17A mRNA表達(見圖2)。

A、B: 胃癌組織；C、D：癌旁非癌組織

圖2 IL-17A mRNA在胃癌細胞株中的表達

三、IL-17A對胃癌細胞增殖、凋亡的影響

MTT法檢測結果顯示，與對照組相比，IL-17A能顯著刺激SGC7901細胞增殖，作用呈劑量和時間依賴性(見圖3)。

流式細胞術檢測結果顯示，IL-17A 10、100 ng/mL組SGC7901細胞凋亡率較0 ng/mL 組顯著降低(P<0.05)，10、100 ng/mL組間凋亡率無明顯差異(P>0.05)(見圖4)。

四、IL-17A對胃癌細胞IL-6、MMP-13 mRNA表達的影響

real-time RT-PCR法檢測結果顯示，IL-17A 10、100 ng/mL組SGC7901細胞IL-6、MMP-13 mRNA表達水平較0 ng/mL組顯著上調，作用呈劑量依賴性(P<0.05)(見圖5)。

圖3 IL-17A對SGC7901細胞增殖的影響

圖4 IL-17A對SGC7901細胞凋亡的影響

圖5 IL-17A對SGC7901細胞IL-6、MMP-13 mRNA表達的影響

討 論

IL-17是一種炎性細胞因子，在炎癥反應中發(fā)揮重要作用，與類風濕性關節(jié)炎、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、多發(fā)性硬化、炎癥性腸病等多種炎癥性和自身免疫性疾病相關[4-5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在多種腫瘤組織中表達異常。Miyahara等[6]的研究顯示，分離自卵巢癌組織的浸潤性T細胞中，表達IL-17的Th17細胞比例較正常組織顯著增高。Zhu等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中IL-17表達明顯升高，其主要表達于腫瘤相關巨噬細胞、部分淋巴細胞以及多個核細胞，極少量表達于腫瘤細胞。Le Gouvello等[8]對結腸癌標本的研究顯示，癌組織IL-17表達水平明顯高于相應正常組織。Zhang等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌組織中的IL-17表達水平顯著高于癌旁非癌組織，癌組織IL-17細胞密度與預后密切相關，有望成為預后指標和治療靶點。

本研究分析了IL-17A在胃癌組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的IL-17A表達強度顯著高于癌旁非癌組織，主要表達于炎性細胞和血管內皮細胞，該發(fā)現(xiàn)提示IL-17A可能與腫瘤血管生成有關。Numasaki等[9]的研究顯示，IL-17可激發(fā)血管內皮細胞遷移，促進脈管形成，調節(jié)促血管生成因子分泌，從而促進腫瘤血管生成。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，體外重組人IL-17A可刺激胃癌細胞株SGC7901增殖，抑制H2O2誘導的細胞凋亡，提示IL-17A可能參與了胃癌的惡性演變進程。

IL-6是一種多功能細胞因子，參與調節(jié)細胞增殖、分化、免疫防御等過程。MMP-13屬于間質膠原酶類，具有強大的膠原蛋白降解能力，在基質金屬蛋白級聯(lián)激活中起關鍵作用。IL-6和MMP-13在腫瘤侵襲、轉移過程中發(fā)揮重要作用。IL-6可通過JAK/STATs途徑活化STAT3，導致細胞異常增殖和凋亡障礙，并可促進腫瘤血管生成以及加劇腫瘤組織炎癥等[10]。MMP-13表達受 MAPK信號通路控制，后者是IL-17A信號轉導的重要通路之一[11-12]。本研究結果證實，IL-17A可上調胃癌細胞中的IL-6和MMP-13表達，作用呈劑量依賴性，提示IL-6和MMP-13在IL-17A參與的胃癌發(fā)生機制中可能起一定作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-17A在胃癌組織中呈高表達。體外IL-17A處理可刺激胃癌細胞增殖、抑制細胞凋亡，并上調其腫瘤相關炎性因子IL-6、MMP-13表達。IL-17A可直接或通過誘導炎癥信號通路分子間接促進胃癌進展，有望成為胃癌治療的新靶點。然而，目前IL-17A在腫瘤微環(huán)境中的作用尚未完全明確，其確切作用機制有待進一步研究。

1 Mantovani A, Allavena P, Sica A, et al. Cancer-related inflammation[J]. Nature, 2008, 454 (7203): 436-444.

2 Wu X, Zeng Z, Chen B, et al. Association between polymorphisms in interleukin-17A and interleukin-17F genes and risks of gastric cancer[J]. Int J Cancer, 2010, 127 (1): 86-92.

3 Zhang JP, Yan J, Xu J, et al. Increased intratumoral IL-17-producing cells correlate with poor survival in hepatocellular carcinoma patients[J]. J Hepatol, 2009, 50 (5): 980-989.

4 Tesmer LA, Lundy SK, Sarkar S, et al. Th17 cells in human disease[J]. Immunol Rev, 2008, 223: 87-113.

5 Fouser LA, Wright JF, Dunussi-Joannopoulos K, et al. Th17 cytokines and their emerging roles in inflammation and autoimmunity[J]. Immunol Rev, 2008, 226: 87-102.

6 Miyahara Y, Odunsi K, Chen W, et al. Generation and regulation of human CD4+ IL-17-producing T cells in ovarian cancer[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105 (40): 15505-15510.

7 Zhu X, Mulcahy LA, Mohammed RA, et al. IL-17 expression by breast-cancer-associated macrophages: IL-17 promotes invasiveness of breast cancer cell lines[J]. Breast Cancer Res, 2008, 10 (6): R95.

8 Le Gouvello S, Bastuji-Garin S, Aloulou N, et al. High prevalence of Foxp3 and IL-17 in MMR-proficient colorectal carcinomas[J]. Gut, 2008, 57 (6): 772-779.

9 Numasaki M, Fukushi J, Ono M, et al. Interleukin-17 promotes angiogenesis and tumor growth[J]. Blood, 2003, 101 (7): 2620-2627.

10 Neurath MF, Finotto S. IL-6 signaling in autoimmunity, chronic inflammation and inflammation-associated cancer[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2011, 22 (2): 83-89.

11 Leeman MF, Curran S, Murray GI. The structure, regulation, and function of human matrix metalloproteinase-13[J]. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2002, 37 (3): 149-166.

12 Dong C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming[J]. Nat Rev Immunol, 2008, 8 (5): 337-348.