孫曉萌 朱 瀅 王慶娥 柏建安 林 琳

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科(210029)

胃腸動力障礙是糖尿病(diabetes mellitus, DM)極為常見的并發(fā)癥，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和降糖藥物的作用，其發(fā)病機制涉及氧化應(yīng)激[1]、腸神經(jīng)元減少[2]、糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products, AGEs)形成[3]、Cajal間質(zhì)細胞減少[4]等多個方面。但這些機制尚不能完全解釋DM胃腸動力障礙的病因，隨著研究的深入，胃腸平滑肌肌源性因素在該病中的作用引起關(guān)注，其中平滑肌細胞(smooth muscle cell, SMC)自身病變起關(guān)鍵作用。RhoA/ROCK信號通路在體內(nèi)普遍存在，參與調(diào)節(jié)包括SMC在內(nèi)的多種細胞的功能。近年，RhoA/ROCK信號通路在DM并發(fā)癥中的作用引起了研究者的重視。本實驗通過觀察比較血糖正常者以及DM患者結(jié)腸肌層中RhoA/ROCK信號通路主要信號分子的表達變化，旨在探討該信號通路在DM結(jié)腸動力障礙發(fā)病中的可能作用。

對象與方法

一、研究對象

結(jié)腸組織標本取自2012年9月-2013年12月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科行結(jié)腸癌根治術(shù)患者，收集距腫瘤邊緣5 cm以上的遠端正常結(jié)腸組織。所有標本均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。根據(jù)糖化血紅蛋白水平，將所有研究對象分為對照組和DM組。對照組30例，為結(jié)腸癌無合并DM患者，其中男18例，女12例，平均年齡(59.1±10.0)歲；DM組22例，為結(jié)腸癌合并DM患者，DM均為Ⅱ型，其中男14例，女8例，平均年齡(67.2±10.0)歲。DM診斷依據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)標準。所有患者術(shù)前均未行放化療，均除外甲狀腺功能亢進和糖皮質(zhì)激素類藥物使用史，排除既往有腹部手術(shù)史者。本研究方案經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，入選者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1. 免疫組化法：結(jié)腸組織常規(guī)包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)。加入兔抗RhoA一抗(工作濃度1∶100，Abcam公司)，4 ℃孵育過夜。滴加辣根過氧化物酶標記的二抗(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，室溫孵育45 min。加入二氨基聯(lián)苯胺顯色，自然水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

結(jié)果判斷：胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)為陽性反應(yīng)。每張切片選擇5～10個高倍鏡視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進行分析并計算RhoA陽性細胞面積。

2. 蛋白質(zhì)印跡法：提取結(jié)腸平滑肌組織蛋白，采用BCA法定量蛋白濃度，80 μg蛋白/泳道行SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白，隨后100 V恒壓將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入抗RhoA一抗(工作濃度1∶1 000，Abcam公司)、抗ROCK1一抗(工作濃度1∶1 000，SAB公司)、抗肌球蛋白磷酸酯酶靶點亞單位1(MYPT1)一抗(工作濃度1∶1 000，Cell Signaling Technology, Inc)、抗磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶點亞單位1(p-MYPT1)一抗(工作濃度1∶1 000，Cell Signaling Technology, Inc)和內(nèi)參β-actin(工作濃度1∶1 000，Biogot Biotechnology CO., Ltd)，4 ℃孵育過夜，加入二抗，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、免疫組化結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，RhoA蛋白在對照組和DM患者結(jié)腸縱肌層和橫肌中均有分布，主要表達于細胞質(zhì)；DM組RhoA蛋白陽性染色面積較對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05

二、蛋白質(zhì)印跡結(jié)果

蛋白質(zhì)印跡法顯示，RhoA、ROCK1、MYPT1和p-MYPT1在正常結(jié)腸肌層中的表達灰度值分別為1.15±0.69、0.75±0.05、1.21±0.80和1.04±0.47，其中RhoA、ROCK1和p-MYPT1蛋白的灰度值較DM組(0.62±0.42、0.54±0.09和0.70±0.28)明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而MYPT1蛋白的灰度值無明顯差異(1.21±0.80對0.94±0.50，P>0.05)(圖2)。

討 論

胃腸動力障礙是DM極為常見的并發(fā)癥，約75%的DM患者伴有胃腸道癥狀[1,5]，其中便秘為最常見的癥狀[6]，其病理生理學(xué)特點為結(jié)腸張力和收縮力減弱、蠕動減慢、排空延遲等。目前DM胃腸動力障礙的發(fā)病機制尚未完全明確，多認為與自主神經(jīng)病變、胃腸激素、微血管病變等有關(guān)；近年研究認為胃腸平滑肌肌源性因素對該病的發(fā)生亦有重要作用。

G蛋白(即鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白)是細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最為經(jīng)典的信號分子之一，分為兩類：一類是與膜受體耦合的異三聚體G蛋白，介導(dǎo)細胞因子、生長因子等的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；另一類稱為小分子G蛋白，因其分子質(zhì)量在20～30 kDa 之間而得名。RhoA是小分子G蛋白Rho亞家族中研究最多、最為清楚的成員之一，分布于大多數(shù)具有收縮功能的細胞，如心肌細胞、SMC等[7]。RhoA蛋白常以非活化的RhoA-GDP形式存在于細胞質(zhì)中，當受到細胞外刺激信號如磷脂酶C等的作用時，GDP轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP，RhoA-GDP因此活化成RhoA-GTP，并且轉(zhuǎn)移至細胞膜中[8]。ROCK是RhoA蛋白下游最主要的效應(yīng)分子[9]，是一種分子質(zhì)量約為160 kDa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。ROCK包含ROCK1和ROCK2兩種亞型，其中ROCK1廣泛分布于各種人體組織中，而ROCK2主要分布于骨骼肌和腦組織中[10-11]。

目前已發(fā)現(xiàn)多種細胞外刺激因素可誘導(dǎo)RhoA/ROCK通路活化，活化后的RhoA/ROCK通路可與多條細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用，參與調(diào)節(jié)細胞的多種功能，包括細胞收縮、細胞分化、基因表達、細胞凋亡等。RhoA/ROCK信號通路激活對于不同組織的細胞可產(chǎn)生不同的效應(yīng)，其中對平滑肌組織的生物學(xué)效應(yīng)主要是調(diào)節(jié)SMC收縮。

SMC收縮是一個復(fù)雜事件，其中肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)的磷酸化水平是決定收縮程度的關(guān)鍵因素之一。MLC的磷酸化水平受鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴的肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase, MLCK)和鈣離子非依賴的肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase, MLCP)的雙重調(diào)節(jié)。MLCK磷酸化MLC，導(dǎo)致平滑肌收縮；MLCP通過其亞單位與已磷酸化的MLC結(jié)合，使其去磷酸化，引起平滑肌舒張。MLCP的抑制可使磷酸化MLC表達和平滑肌收縮進一步增強，這種現(xiàn)象稱之為“鈣敏化”。近年，鈣敏化的具體機制成為研究熱點，已證實RhoA及其底物ROCK是介導(dǎo)鈣敏化的主要因素。活化后的ROCK可通過直接磷酸化MLC和抑制MLCP活性雙重途徑來調(diào)節(jié)平滑肌收縮。其中ROCK主要通過兩條途徑抑制MLCP活性，其一是通過磷酸化MLCP的調(diào)節(jié)亞單位MYPT1，使其失去催化MLC脫磷酸化的能力，細胞質(zhì)內(nèi)磷酸化MLC水平提升，平滑肌收縮；因此，p-MYPT1的表達水平常被認為是ROCK活性的重要標志。另一條途徑是ROCK通過磷酸化一種平滑肌特異性磷蛋白CPI-17，使其發(fā)生一系列構(gòu)象改變而抑制MLCP活性。

1 Da=0.992 1 u

研究證實，高血糖可引起一系列的代謝紊亂，包括蛋白質(zhì)的非酶糖化、氧化應(yīng)激以及一些信號通路的異常。近年RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在DM并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展中的作用引起人們的重視，但目前該信號通路與DM并發(fā)癥關(guān)系的研究主要集中在神經(jīng)、心血管以及腎臟等系統(tǒng)病變，在胃腸病變中的研究較少。平滑肌是維持胃腸運動的基礎(chǔ)，胃腸動力性疾病的發(fā)生與平滑肌收縮性的改變密切相關(guān)。Bhetwal等[12]探討平滑肌病變與DM胃輕癱的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，DM胃輕癱小鼠胃平滑肌組織中ROCK的表達減少，推測DM胃輕癱的發(fā)生可能部分與RhoA/ROCK信號通路被抑制有關(guān)；研究[13]還表明，在結(jié)腸炎等疾病狀態(tài)下存在腸運動紊亂時，一些鈣敏感蛋白如MYPT1和CPI-17的表達異常。但迄今尚缺乏RhoA/ROCK信號通路活性改變對DM結(jié)腸動力影響的報道。

文獻報道，約60%的DM患者存在結(jié)腸動力障礙[14]。本研究的前期研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，DM大鼠結(jié)腸平滑肌收縮性減弱，結(jié)腸轉(zhuǎn)運時間延遲；同時DM大鼠結(jié)腸平滑肌組織中MLC的磷酸化表達減少。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，DM結(jié)腸肌層中RhoA蛋白和ROCK1蛋白表達較對照組明顯減少，提示RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑表達下調(diào)；p-MYPT1蛋白表達減少，進一步表明RhoA/ROCK信號通路活性被抑制，由此推測DM結(jié)腸組織內(nèi)RhoA/ROCK信號通路活性被抑制以及由此導(dǎo)致的MLC磷酸化表達減少可能與DM結(jié)腸動力障礙有一定相關(guān)性。但由于本研究所納入對象均未行結(jié)腸動力測定，缺乏臨床動力學(xué)參數(shù)，尚無法判斷該信號通路的活性變化與DM結(jié)腸動力障礙的確切關(guān)系，還有待于DM動物模型以及細胞水平的進一步研究探討。

AGEs是蛋白質(zhì)和脂類非酶糖基化后生成的多種不同物質(zhì)的統(tǒng)稱，廣泛存在于血液和各種組織中。正常人體內(nèi)AGEs水平隨年齡增長緩慢增加，但在DM狀態(tài)下，AGEs能加速形成。通過對DM患者或DM動物模型的研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，DM血清或結(jié)腸組織中AGEs水平均顯著升高。AGEs與DM的多種并發(fā)癥密切相關(guān)，其可通過氧化應(yīng)激、糖基化修飾某些蛋白等受體依賴性和非依賴性途徑促進DM并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展[19]。RAGE是第一個被報道的AGEs受體，屬免疫球蛋白超家族成員。AGEs及其受體RAGE已被作為DM并發(fā)癥的重要病理機制[20]，包括心臟病[21]、腎病[22]、視網(wǎng)膜病變[23]等。根據(jù)對組織器官的影響，AGEs及其受體RAGE可能參與介導(dǎo)了DM胃腸道并發(fā)癥的發(fā)生，但具體機制目前尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，SMC、內(nèi)皮細胞等均表達RAGE。本研究的前期研究[16]提示，AGEs能抑制結(jié)腸SMC內(nèi)MLC的磷酸化，結(jié)合本研究結(jié)果，推測AGEs可能部分通過抑制結(jié)腸肌層組織中RhoA/ROCK信號通路活性引起MLC的磷酸化減少，最終導(dǎo)致平滑肌收縮減弱、結(jié)腸動力障礙。但AGEs是否可抑制RhoA/ROCK信號通路以及AGEs是否通過RAGE受體等受體依賴途徑抑制該信號通路等均有待于細胞實驗的進一步探討。

綜上所述，RhoA/ROCK信號通路活性下降可能與DM結(jié)腸動力障礙有關(guān)，但DM時該通路活性改變的具體機制尚未完全闡明，有待繼續(xù)研究。隨著基礎(chǔ)研究的進一步深入以及臨床經(jīng)驗的不斷積累，DM合并便秘的治療方法必將進一步完善，從而提高療效。

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