張偉錚 陳力 趙瑾 陳江漢

(1.廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院檢驗科，廣州 510006;2.上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點實驗室第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

淺部真菌病(Superficial mycosis)是指由致病真菌或條件致病真菌感染人體皮膚、毛發(fā)和甲等淺表組織而引起的一組疾病。在我國人群患病率可達20% ～25%，其發(fā)病率仍呈逐年增加趨勢［1］。臨床主要的致病真菌以皮膚癬菌為主，

但近年來其他致病真菌如念珠菌等感染有明顯增加［2］。為了解上海長征醫(yī)院皮膚科門診淺部真菌病的病原菌菌種構(gòu)成特點，以便指導(dǎo)治療，對2013年4月～2013年11月就診于皮膚科門診的297例淺部真菌病患者，進行致病真菌菌種分析。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

對于297例臨床診斷為淺部真菌病且真菌直接鏡檢陽性者 (花斑癬除外)，進一步進行真菌培養(yǎng)及菌種鑒定。診斷標(biāo)準(zhǔn)是:具有典型臨床表現(xiàn)，甲屑、皮屑、病發(fā)真菌鏡檢和培養(yǎng)陽性。年齡范圍在2～87歲。

1.2 真菌鏡檢及培養(yǎng)

①取材:取患者的病發(fā)、皮屑或甲屑。②真菌鏡檢:將標(biāo)本置于載玻片上，加1滴10%KOH，覆蓋蓋玻片在顯微鏡下觀察，找到菌絲或孢子為陽性。③真菌培養(yǎng):將病發(fā)、皮屑及甲屑接種于含氯霉素 (0.05 g/L)的沙氏培養(yǎng)基 (SDA)，28℃培養(yǎng)2周，隔天取出觀察生長情況。

1.3 菌株鑒定

對絲狀菌用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)、尿素瓊脂培養(yǎng)基、米飯培養(yǎng)基進一步分離培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)特征及顏色、菌落生長速度、分生孢子的形態(tài)及菌絲特征等進行鑒定;念珠菌轉(zhuǎn)種科瑪嘉念珠菌顯示培養(yǎng)基和米粉培養(yǎng)基進行鑒定，無法明確菌株使用梅里埃API 20C AUX酵母菌鑒定試劑盒鑒定，操作方法參照試劑說明書。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

對少見及疑難菌株進行rDNA ITS區(qū)間序列測定，確切鑒定菌種。①DNA提取:使用氯化芐(benzyl chloride)法提取基因組DNA，具體操作見參考文獻［3］。②PCR擴增:引物分別選用真菌通用 引 物 ITS4、ITS5［4］。 引 物 序 列 為 ITS5:5 ＇-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 ＇，ITS4:5 ＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇;PCR 擴增體系 25 μL，包括 3 μL 模板 DNA，20 μmol引物各 0.25 μL，dNTPmix 12.5 μL，余體積用水補齊。PCR 條件:94℃預(yù)變性 5 min;94℃變性 60 s，55℃退火 60 s，72℃延伸60 s，30個循環(huán);72℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。③序列測定:PCR產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行雙向測序。測序結(jié)果在 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)數(shù)據(jù)庫中進行比對鑒定菌種。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料分析

297例患者鏡檢培養(yǎng)均為陽性，男性161例，女性136例，其中甲癬 138例 (46.5%)，男63例，女75例;手足癬68例 (22.9%)，男34例，女34例;體癬60例 (20.2%)，男46例，女 14例;股癬28例 (9.4%)，男18例，女10例;頭癬3例(1.0%)，均為女性。其中不同性別的甲癬、體癬的 χ2值分別是 7.60 和 15.28，P＜0.01，差異性具有統(tǒng)計學(xué)意義;其余3種疾病不具有統(tǒng)計學(xué)意義。不同年齡段的甲癬 χ2值是12.09，P＜0.01，差異性具有統(tǒng)計學(xué)意義;其余4種疾病均不具備統(tǒng)計學(xué)意義。淺部真菌病不同性別、年齡的具體分布見表1。

2.2 真菌培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

在分離的297株菌株中，經(jīng)過形態(tài)觀察、試劑盒鑒定及ITS基因序列測序，共鑒定出致病菌13種。其中紅色毛癬菌86株 (29.0%);須癬毛癬菌68 株 (22.9%);念珠菌屬59 株 (19.9%)，其中近平滑念珠菌32株，克柔念珠菌12株，光滑念珠菌7株，白色念珠菌4株，熱帶念珠菌2株，土生念珠菌1株，季也蒙念珠菌1株;暗色菌屬13株 (4.4%)，其中鏈格孢4株，球孢枝孢2株，枝狀枝孢2株、新月彎孢霉1株，同心盾殼霉1株，其余3株無法鑒定到種;曲霉菌屬13株 (4.4%)，其中煙曲霉7株，黃曲霉3株，黑曲霉3株;紅酵母菌 12株 (4.0%);青霉菌屬 9株 (3.0%);毛霉菌9株 (3.0%);犬小孢子菌5株 (1.7%);淺白隱球菌3株 (1.0%);毛孢子菌屬2株(0.7%)，真皮毛孢子菌和阿薩希毛孢子菌各1株;絮狀表皮癬菌1株 (0.3%);混合感染17株(5.7%)，主要為紅色毛癬菌、須癬毛癬菌或念珠菌屬與紅酵母菌的混合感染。淺部真菌病病種及病原菌具體分布情況見表2。

3 討 論

淺部真菌病是指皮膚、指甲、趾甲和毛發(fā)發(fā)生的真菌感染，是臨床最常見的真菌病，不同的菌種可引起不同的臨床表現(xiàn)［5］。世界范圍內(nèi)淺部真菌病患病率為20% ～25%，并且隨著免疫制劑的廣泛應(yīng)用、社會人口老齡化、美容業(yè)興起、家庭豢養(yǎng)寵物風(fēng)行及診斷檢測水平的提高等綜合因素，使淺部真菌病的發(fā)病率有逐年增加趨勢，其病種與病原學(xué)特點也存在著地區(qū)差別［6］。了解淺部真菌病的特點對臨床開展防治具有重要指導(dǎo)意義。

本組研究中，男女患者的總構(gòu)成比基本相等，這與國內(nèi)外報道的男性患者明顯多于女性患者有所差異［7］，這可能與樣本選取的大小及所在的地區(qū)不同有關(guān)，而體股癬發(fā)病男性多于女性，這可能與男性勞動力度強、汗腺及皮脂腺分泌旺盛，易出汗等關(guān)系密切;甲癬發(fā)病女性多于男性，這可能與女性喜愛美甲及所穿鞋偏緊、透氣不足有關(guān)。這與一些相關(guān)的報道存在差異［5］，這種差異可能與不同的地理、生活環(huán)境等因素有關(guān)。

表1 淺部真菌病不同性別、年齡分布(n，%)Tab.1 The different gender and age distributions of superficial mycosis

表2 淺部真菌病病種及病原菌分布情況(n，%)Tab.2 The disease category and pathogens of superficial mycosis

本研究還顯示同一病種在不同年齡組的發(fā)病率不同，淺部真菌病以18～44歲年齡組發(fā)病率最高(47.5%)，這可能與青壯年生理功能較旺盛、社會活動頻繁、衛(wèi)生習(xí)慣不良及就診率高有關(guān);另外，該研究還發(fā)現(xiàn)中老年真菌感染率所占比率也不少，分別是24.2%和24.6%，這可能與年齡的增長、基礎(chǔ)性疾病增加及免疫抑制劑使用導(dǎo)致免疫功能下降，發(fā)生真菌感染有關(guān);兒童淺部真菌病的發(fā)病率較低 (3.7%)，其中頭癬患者僅0.7%，這與其他地區(qū)報道不同［2，5，8］，這可能與本地區(qū)經(jīng)濟較發(fā)達，家長比較注重子女的衛(wèi)生情況有關(guān)。

在本次研究中，真菌鏡檢培養(yǎng)陽性患者297例，甲癬138例 (46.5%)，其次是手足癬68例(22.9%)，體癬 60 例 (20.2%)，股癬 28 例 (9.4%)，由此可見甲癬是本地區(qū)較為常見的淺部真菌病。不同地區(qū)淺部真菌病病種存在差異，可能與地域、氣候、生活習(xí)慣等不同有關(guān)［8-9］。從附表可知，真菌檢出前三位分別為紅色毛癬菌(29.0%)、須癬毛癬菌 (22.9%)和念珠菌屬 (19.9%)，念珠菌屬相比其他菌種有明顯的增加，存在南北差異性，可能跟本地區(qū)地處南方，天氣炎熱潮濕，更利于念珠菌屬的生長繁殖，造成皮膚淺部真菌病的發(fā)生，是甲癬的主要致病菌 (11.8%)，其中近平滑念珠菌(32株)的比例要遠遠高于白色念珠菌 (4株)，這與相應(yīng)的文獻報道不一致，具體原因有待進一步研究。本次研究還檢出暗色真菌屬 (4.4%)、曲霉菌屬 (4.4%)、紅酵母菌 (4.0%)、青霉菌屬 (3.0%)等通常被認(rèn)為是污染菌的菌種，但本次選擇的是涂片及培養(yǎng)均陽性的病例，且癥狀典型，培養(yǎng)菌種單一，基本可排除污染可能。這些菌種在其他文獻中較少提及，當(dāng)人類皮膚破損或者免疫功能低下時，可導(dǎo)致人體皮膚組織和內(nèi)臟器官的真菌感染。并且隨著器官移植、免疫抑制治療的廣泛使用及實驗室診斷技術(shù)的提高，這些菌種所致感染的病例報道將日趨增加，淺部真菌病的致病菌種將越來越廣泛，不能忽視一些少見真菌如鏈格孢引起的真菌病，從另一個角度也說明淺部真菌病的致病菌種在不斷發(fā)生變遷，這可能與生活水平、生活習(xí)慣、人口流動及近年來城市居民飼養(yǎng)寵物多，親動物性皮膚癬菌的感染幾率高有關(guān)，應(yīng)不斷調(diào)查淺部真菌病致病菌種的變遷，為臨床上合理用藥提供依據(jù)。

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