陳陽霞 顧桉菁 梁宇恒 馬團(tuán) 席麗艷

(1.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣州 510120;2.貴陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004)

馬爾尼菲青霉是一種雙相型真菌，室溫培養(yǎng)時(shí)以菌絲形態(tài)生長，37℃培養(yǎng)或感染人體后以酵母細(xì)胞形態(tài)生長，感染人體后可引起一種嚴(yán)重的深部真菌病，該病在免疫受損患者尤其是HIV感染患者中多見［1］。有研究表明，馬爾尼菲青霉的致病性與acuD、hsp 70和hsp 90等基因有關(guān)［2-4］。通過克隆目的基因并將其連接到真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入真核細(xì)胞，是研究真核細(xì)胞基因功能常用的方法。絲狀真菌常用的轉(zhuǎn)化方法有原生質(zhì)體法、醋酸鋰法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、電穿孔法和生物彈道技術(shù)等。其中最常用的是原生質(zhì)體法，關(guān)鍵是要用蝸牛酶、纖維素酶等消化細(xì)胞壁。但是制備原生質(zhì)體時(shí)，因不同時(shí)間配制的酶解液在濃度或性能上有所差異，導(dǎo)致原生質(zhì)體的形成速度不同，所以每次制備過程都需多次觀察且不容易控制。利用生物彈道技術(shù)轉(zhuǎn)化，則首先要用鎢對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行包裝，再通過高速離子轟擊將其轉(zhuǎn)化入孢子和菌絲［5］。直接使用萌發(fā)孢子進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化，則不需制備原生質(zhì)體。電穿孔轉(zhuǎn)化法原理是瞬時(shí)電擊導(dǎo)致細(xì)胞膜形成可逆的通透性，形成微孔通道，從而使質(zhì)粒DNA進(jìn)出細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化［6］。有研究表明，電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化率較原生質(zhì)體法高，且大部分轉(zhuǎn)化子都是單拷貝，在基因組隨機(jī)分配，更適合絲狀真菌的轉(zhuǎn)化［7］。該方法已在多種絲狀真菌中得到應(yīng)用，如煙曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉等［8］。在本研究中，直接使用萌發(fā)的馬爾尼菲青霉孢子進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化，從孢子齡、孢子萌發(fā)時(shí)間、質(zhì)粒濃度和電場強(qiáng)度等方面考察各個(gè)因素對(duì)電穿孔轉(zhuǎn)化效率的影響，期望得到關(guān)于馬爾尼菲青霉高效轉(zhuǎn)化方法。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株和載體 馬爾尼菲青霉缺陷株SPM4(pyrG-，niaD-)和質(zhì)粒pALX223(克隆含構(gòu)巢曲霉pyrG基因)均為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)真菌和真菌病研究中心惠贈(zèng)。

培養(yǎng)基 培養(yǎng)攜帶質(zhì)粒pALX223的重組大腸桿菌 (Escherichia coli)DH5α，使用含 100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。真菌培養(yǎng)基:PDA+U培養(yǎng)基，EP+U培養(yǎng)基、SDB液體培養(yǎng)基、蔗糖SD培養(yǎng)基和SD培養(yǎng)基。具體配制方法參考文獻(xiàn)［9］。

主要試劑 內(nèi)切酶XhoI和BamHI購自Thermo Scientific公司、質(zhì)粒中提試劑盒購自Promega公司、大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根公司。

主要儀器 Eppendorf高速冷凍離心機(jī)、Leica DM2500相差顯微鏡和成像系統(tǒng)、Bio-Rad gene pulser II電穿孔儀等。

1.2 質(zhì)粒的提取、酶切和回收

使用含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基復(fù)蘇和擴(kuò)大培養(yǎng)攜帶質(zhì)粒pALX223的重組大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α。將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液按照Promega公司質(zhì)粒中提試劑盒說明書 (編號(hào)CTM253)依次經(jīng)過裂解產(chǎn)物制備、DNA純化、洗滌、洗脫等步驟提取質(zhì)粒并測OD值;取適量質(zhì)粒按Thermo Scientific公司內(nèi)切酶XhoI和BamHI說明書制備酶切體系;最后按照北京天根公司大量瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒說明書 (目錄號(hào)DP210)依次經(jīng)過跑膠、切膠、溶膠等步驟對(duì)酶切后目的DNA進(jìn)行回收。

1.3 感受態(tài)孢子的制備

用無菌水從PDA+U斜面上洗下26℃培養(yǎng)一定天數(shù)的SPM4孢子，接種于EP+U培養(yǎng)基，使孢子濃度達(dá)到106個(gè)/mL，于37℃，150 r/min條件下培養(yǎng)一定時(shí)間使孢子萌發(fā)，期間每隔1 h收集部分孢子懸液并取樣顯微鏡觀察孢子形態(tài)，將各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的孢子懸液用冰預(yù)冷1M山梨醇洗滌3次制備感受態(tài)孢子并將其調(diào)整至107個(gè)/mL，置冰上備用。

1.4 轉(zhuǎn)化

冰上取60 μL SPM4感受態(tài)孢子懸液，加入一定量的質(zhì)粒DNA和無菌水，使終體積為70 μL，同時(shí)設(shè)一組不加質(zhì)粒DNA的陰性對(duì)照?；旌衔镌诒戏胖?5 min后轉(zhuǎn)入0.2 cm電擊杯中，在一定電場強(qiáng)度下電擊。電擊后立即加入930 μL 1M冰預(yù)冷山梨醇，冰上放置30 min后加入2 mL SDB液體培養(yǎng)基，37℃，150 r/min培養(yǎng)90 min。離心去上清(留100 μL)涂布于蔗糖SD培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)5～7 d后挑取生長出的單菌落進(jìn)行純化。

1.5 轉(zhuǎn)化子的篩選和純化

使用SD培養(yǎng)基進(jìn)行篩選和純化。挑取單菌落點(diǎn)種SD培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)，無菌水洗下相應(yīng)轉(zhuǎn)化子的孢子，稀釋后涂布于上述篩選平板，挑取單菌落再進(jìn)行第二次產(chǎn)孢培養(yǎng)和稀釋涂布。若該單菌落兩次產(chǎn)孢培養(yǎng)均可正常生長，則將其所對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化子記為陽性轉(zhuǎn)化子，余記為陰性。具體方法參考文獻(xiàn)［10］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

考察孢子齡、孢子萌發(fā)時(shí)間、質(zhì)粒濃度、電場強(qiáng)度和質(zhì)粒線性化對(duì)電轉(zhuǎn)化效率影響時(shí)，各個(gè)組合進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，使用Microsoft Excel記錄各個(gè)組合各次實(shí)驗(yàn)的陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)并將其導(dǎo)入Graph-Pad Prism 5軟件制圖，數(shù)據(jù)描述以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組均數(shù)比較采用 Student＇s t-test(*.P＜0.05;＊＊.P＜0.01)。

2 結(jié) 果

2.1 孢子齡對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

收集培養(yǎng)5～9 d的SPM4孢子。其他條件為:孢子萌發(fā)時(shí)間 4 h;電場強(qiáng)度 5 kV/cm;環(huán)狀pALX223質(zhì)粒1 μg。由圖1知，當(dāng)孢子齡為6 d時(shí)，獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)達(dá)到峰值，使用培養(yǎng)6 d的孢子可獲得最高的轉(zhuǎn)化率。

2.2 孢子萌發(fā)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

收集培養(yǎng)6 d的SPM4孢子，光鏡下觀察不同時(shí)間的孢子形態(tài)，由圖2知，隨著萌發(fā)時(shí)間的增加，孢子有逐漸聚集的趨勢，3 h部分孢子開始萌發(fā)，4 h孢子基本萌發(fā)，5 h部分孢子已有菌絲生成和聚集。其他條件為:電場強(qiáng)度 5 kV/cm;環(huán)狀pALX223質(zhì)粒1 μg。由圖3知，當(dāng)孢子萌發(fā)4 h，獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)達(dá)到峰值，使用萌發(fā)4 h的孢子能獲得最高的轉(zhuǎn)化率。

2.3 電場強(qiáng)度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

在4.0～7.5 kV/cm范圍內(nèi)利用不同的電場強(qiáng)度電擊［7，11］，觀察其對(duì)馬爾尼菲青霉轉(zhuǎn)化率的影響。其他條件為:孢子齡6 d;孢子萌發(fā)時(shí)間4 h;環(huán)狀pALX223質(zhì)粒1 μg。由圖4知，使用5 kV/cm的電場強(qiáng)度可獲得最高的轉(zhuǎn)化效率。

2.4 質(zhì)粒量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

利用不同量的環(huán)狀pALX223質(zhì)粒DNA對(duì)SPM4進(jìn)行轉(zhuǎn)化。其他條件為:孢子齡6 d;孢子萌發(fā)時(shí)間4 h;電場強(qiáng)度5 kV/cm。由圖5知，轉(zhuǎn)化子數(shù)隨質(zhì)粒量的增加而增加，當(dāng)加入質(zhì)粒量達(dá)到1 μg時(shí)，轉(zhuǎn)化子數(shù)增加趨勢趨于平緩，加入質(zhì)粒量增加至2 μg時(shí)轉(zhuǎn)化子數(shù)基本不再增長，加入1～2 μg的質(zhì)粒DNA可獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。

2.5 質(zhì)粒線性化對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

分別使用1 μg環(huán)狀或線性化pALX223質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化SPM4，以研究質(zhì)粒線性化對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。其他條件為:孢子齡6 d;孢子萌發(fā)時(shí)間4 h;電場強(qiáng)度5 kV/cm。由圖6知，使用環(huán)狀pALX223質(zhì)粒DNA平均獲得轉(zhuǎn)化子21個(gè)，而使用XhoI和BamHI酶切線性化的pALX223質(zhì)粒DNA平均獲得轉(zhuǎn)化子13個(gè)，環(huán)狀質(zhì)粒較線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率高(＊＊.P＜0.01)。

圖1 孢子齡對(duì)SPM4轉(zhuǎn)化率的影響(其他條件為:孢子萌發(fā)時(shí)間4 h;電場強(qiáng)度5 kV/cm;環(huán)狀pALX223質(zhì)粒1 μg) 圖2 不同萌發(fā)時(shí)間SPM4孢子光鏡下形態(tài)(400×) 圖3 孢子萌發(fā)時(shí)間對(duì)SPM4轉(zhuǎn)化率的影響(其他條件為:孢子齡6 d;電場強(qiáng)度5 kV/cm;環(huán)狀pALX223質(zhì)粒1 μg) 圖4 電場強(qiáng)度對(duì)SPM4轉(zhuǎn)化率的影響(其他條件為:孢子齡6 d;孢子萌發(fā)時(shí)間4 h;環(huán)狀pALX223質(zhì)粒1 μg) 圖5 質(zhì)粒量對(duì)SPM4轉(zhuǎn)化率的影響(其他條件為:孢子齡6 d;孢子萌發(fā)時(shí)間4 h;電場強(qiáng)度5 kV/cm) 圖6 環(huán)狀或線性化質(zhì)粒對(duì)SPM4轉(zhuǎn)化率的影響(其他條件為:孢子齡6 d;孢子萌發(fā)時(shí)間4 h;電場強(qiáng)度5 kV/cm)。注:柱狀圖中柱形代表3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值 (＊＊.P＜0.01)Fig.1 Effect of spore stadium on transformation frequency of SPM4.Other conditions:germination time 4 h，electric field intensity 5 kV/cm and circular plasmids pALX223 1 μg Fig.2 Microscopic morphology of germinated spores of SPM4 at different time(400 × )Fig.3 Effect of germination time on transformation frequency of SPM4.Other conditions:spore stadium 6 d，electric field intensity 5 kV/cm and circular plasmids pALX223 1 μg Fig.4 Effect of electric field intensity on transformation frequency of SPM4.Other conditions:spore stadium 6 d，germination time 4 h and circular plasmids pALX223 1 μg Fig.5 Effect of plasmid amount on transformation efficiency of SPM4.Other conditions:spore stadium 6 d，germination time 4 h and electric field intensity 5 kV/cm Fig.6 Effect of circular or linearized plasmids on transformation frequency of SPM4.Other conditions:spore stadium 6 d，germination time 4 h and electric field intensity 5 kV/cm.The bars are representative of the mean values of three independent experiments.Statistical significance was determined by Student＇s t-test(＊＊.P ＜ 0.01)

3 討 論

通過對(duì)影響轉(zhuǎn)化率的幾個(gè)主要因素的研究，發(fā)現(xiàn)適合SPM4電穿孔轉(zhuǎn)化條件為:孢子齡為6d，孢子萌發(fā)時(shí)間為4 h，電場強(qiáng)度為5 kV/cm。在上述條件下分別使用1 μg環(huán)狀或線性化質(zhì)粒pALX223 DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，平均可以得到21個(gè)和13個(gè)轉(zhuǎn)化子。當(dāng)孢子齡為6 d時(shí)獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)達(dá)到峰值，可能是該時(shí)間段的孢子較新鮮且豐富，萌發(fā)能力較強(qiáng)適合轉(zhuǎn)化。結(jié)合不同萌發(fā)時(shí)間的孢子形態(tài)及相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行分析，當(dāng)SPM4的孢子萌發(fā)時(shí)間為0 h時(shí)轉(zhuǎn)化率為0可能是由于SPM4轉(zhuǎn)化效率本身極低，萌發(fā)時(shí)間為0 h時(shí)的孢子具有較厚的細(xì)胞壁，電穿孔很難形成微孔通道使質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞完成轉(zhuǎn)化。隨著萌發(fā)時(shí)間增加，轉(zhuǎn)化率隨著萌發(fā)時(shí)間的增加而上升，可能是由于萌發(fā)孢子為適應(yīng)菌絲生成，體積逐漸變大而細(xì)胞壁厚度相應(yīng)降低，從而有利于轉(zhuǎn)化。當(dāng)萌發(fā)時(shí)間為5 h時(shí)轉(zhuǎn)化率急劇下降可能是由于菌絲的生成和聚集。轉(zhuǎn)化率先隨著電場強(qiáng)度的加大而上升，但當(dāng)電場強(qiáng)度大于5 kV/cm時(shí)，轉(zhuǎn)化率反而下降，可能是過高的電場強(qiáng)度導(dǎo)致大量孢子死亡。在電穿孔過程中，電場強(qiáng)度偏低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不宜極化產(chǎn)生微孔通道，造成質(zhì)粒DNA不能進(jìn)入細(xì)胞，無法完成轉(zhuǎn)化;而電場強(qiáng)度過高，會(huì)導(dǎo)致大部分細(xì)胞產(chǎn)生較大的孔洞，不易復(fù)原而死亡，從而降低了細(xì)胞的存活率，也影響了轉(zhuǎn)化率［12］。質(zhì)粒量過多或過少均影響轉(zhuǎn)化率?？赡苁钱?dāng)質(zhì)粒量過少時(shí)，質(zhì)粒DNA太少不足以產(chǎn)生高轉(zhuǎn)化效率［13］;而當(dāng)質(zhì)粒量增大超過閾值時(shí)，細(xì)胞能吸收的質(zhì)粒DNA達(dá)到飽和，繼續(xù)增加質(zhì)粒量也不會(huì)增加轉(zhuǎn)化效率。相關(guān)原因仍需進(jìn)一步研究，是否高濃度的質(zhì)粒DNA影響了細(xì)胞表面的電位變化或是封閉了DNA進(jìn)入的通道還有待考察［14］。本研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)SPM4的萌發(fā)孢子，環(huán)狀質(zhì)粒較線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率高，這與袁錫華的研究結(jié)論一致［9］。但本研究的前提是SPM4產(chǎn)孢能力較強(qiáng)，對(duì)于不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢能力弱的菌株則不適用。

由于文獻(xiàn)中可循的馬爾尼菲青霉成功電轉(zhuǎn)參數(shù)極少，本研究參考黑曲霉、釀酒酵母和大腸桿菌電穿孔轉(zhuǎn)化相關(guān)文獻(xiàn)［10，12-13］，通過限定部分電轉(zhuǎn)參數(shù)來一一摸索各因素較優(yōu)化的水平，建立了高效、簡便的馬爾尼菲青霉電穿孔轉(zhuǎn)化體系，滿足后續(xù)馬爾尼菲青霉基因功能研究的需求。因此認(rèn)為該方法在本實(shí)驗(yàn)中同樣適用。本研究沒有采用多因素多水平交互式表格設(shè)計(jì)是因?yàn)槠鋵?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜，所需樣本量極大，誤差也極大，且需要耗費(fèi)大量時(shí)間和費(fèi)用。

電穿孔轉(zhuǎn)化方法具有快速、簡單、易于操作、重復(fù)性好和轉(zhuǎn)化效率高等特點(diǎn)，比原生質(zhì)體法更適合馬爾尼菲青霉的轉(zhuǎn)化。馬爾尼菲青霉電穿孔轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化為其基因功能研究提供了良好的平臺(tái)。

4 致 謝

感謝北京大學(xué)醫(yī)學(xué)真菌和真菌病研究中心惠贈(zèng)菌株和質(zhì)粒。

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