孟凡榮 陳琛 綜述 萬海粟 周清華 審校

慢病毒載體作為一類來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，以其轉(zhuǎn)染效率高，可感染分裂期和非分裂期細胞，可容納較大的基因片段等優(yōu)點，有著廣泛的應用前景[1-4]。

1 慢病毒載體的來源

慢病毒屬（lentivirus）在分類上屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，為二倍體RNA病毒。原發(fā)感染的細胞以淋巴和巨噬細胞為主，導致感染個體發(fā)病。慢病毒感染的主要臨床特點是在出現(xiàn)典型的臨床癥狀以前，經(jīng)歷較長的潛伏期，之后緩慢發(fā)病，因此被稱為慢病毒。而慢病毒載體則是以慢病毒的基因組為基礎(chǔ)，將其中多個和病毒活性相關(guān)的序列結(jié)構(gòu)去除，使其具有生物學的安全性，然后，再在這個基因組骨架中引入實驗所需要的目標基因的序列和表達結(jié)構(gòu)，并將之制備成載體[5]。早期的慢病毒載體，是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）改裝而來，包括HIV-1型載體系統(tǒng)和HIV-2型載體系統(tǒng)。

后來隨著研究的深入，研究人員也開發(fā)了許多其他類型的慢病毒載體系統(tǒng)，主要包括猿類免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）載體系統(tǒng)、貓免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）載體系統(tǒng)、馬傳染性貧血病毒（equine infectious anemia virus,EIAV）載體體系、山羊類關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒（caprine arthritis-encephalitis virus, CAEV）載體系統(tǒng)、牛免疫缺陷病毒（bovine immunodeficiency birus, BIV）載體系統(tǒng)、綿羊髓鞘脫落病毒（visna/maedi virus, VMV）載體系統(tǒng)等。顯然，來源不同物種的載體系統(tǒng)可能會更有效的在相應物種細胞進行基因轉(zhuǎn)染實驗，而是否可以在不同物種類型細胞中交叉使用慢病毒載體，特別是是否可以將其他物種的慢病毒體系用于人類，還需要進一步研究和評估[6,7]。HIV載體系統(tǒng)使用非常廣泛，以下的內(nèi)容將主要以HIV-1為例子對慢病毒載體系統(tǒng)進行介紹。

圖1 HIV-1的基因結(jié)構(gòu)Fig 1 Structure of human immunodeficiency virus (HIV)-1

2 慢病毒載體系統(tǒng)的建立

如前所述，慢病毒屬于反轉(zhuǎn)錄病毒。HIV-1為雙鏈RNA病毒，它的基因組結(jié)構(gòu)（圖1）和其他的反轉(zhuǎn)病毒類似，含有可編碼三種主要病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基因，即gag、pol和env，gag基因編碼病毒的核心蛋白如核衣殼蛋白（p7）、內(nèi)膜蛋白（p17）和衣殼蛋白（p24）；pol基因編碼病毒復制相關(guān)的酶；env基因編碼病毒包膜糖蛋白。此外，病毒基因組還編碼兩個調(diào)節(jié)蛋白，即tat、rev，rev主要參與蛋白調(diào)節(jié)的表達水平，tat參與蛋白轉(zhuǎn)錄的控制，與病毒的長末端重復序列（long terminal repeats,LTRS） 結(jié)合后促進病毒的所有基因的轉(zhuǎn)錄。以及四個輔助蛋白，即vif、vpr、vpu、nef[8,9]。在HIV-1的基因組結(jié)構(gòu)上，還含有病毒生命史所需要的其他序列結(jié)構(gòu)，例如病毒復制和包裝等所需要的信號等。

HIV-1型慢病毒載體系統(tǒng)的建立，經(jīng)歷了一個逐步完善的過程。其主要的目的，是提高載體的生物安全性。這主要分為以下四個階段:

第一代是兩質(zhì)粒系統(tǒng)，以HIV-1為骨架構(gòu)建起來的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，包含3個結(jié)構(gòu)基因env、gag和pol，2個調(diào)控基因tat、rev和4個輔助基因vpr、vif、vpu和nef，兩端有長末端重復序列（long terminal repeat, LTR），5'LTR和gag之間還有病毒包裝信號序列。慢病毒載體最初的包裝是將HIV基因組中的反式作用蛋白基因序列去除，然后包裝上含有目標基因的重組載體和能夠反式提供病毒顆粒所需蛋白的包裝質(zhì)粒，同時共轉(zhuǎn)染包裝細胞（如293T細胞）進行包裝。這是一個復制缺陷型的載體體系，產(chǎn)生病毒的滴度很低，而且只能感染CD4+細胞，在轉(zhuǎn)染過程中包裝的蛋白DNA和載體DNA有重組的可能，進而有產(chǎn)生有復制能力病毒（replication competentvirus, RCV）[10,11]，具有產(chǎn)生活性HIV病毒的很大風險。

第二代的三質(zhì)粒表達系統(tǒng)，也就是將HIV-1基因組中負責包裝，逆轉(zhuǎn)錄和整合所需要的順式作用序列結(jié)構(gòu)和編碼反式作用蛋白的序列分離，再克隆到三個獨立的質(zhì)粒中，其中一個是包裝質(zhì)粒，含有CMV啟動子，控制除env的所有病毒結(jié)構(gòu)基因的表達，第二個是包膜質(zhì)粒，含有表達水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因的序列，這個基因用于代替原病毒的env基因，這個基因的產(chǎn)物，可以提高病毒的宿主范圍，而另一個則是載體質(zhì)粒，其中含有研究人員所感興趣的基因序列結(jié)構(gòu)。但這個三質(zhì)粒系統(tǒng)還是保留了HIV-1的附屬基因，這個質(zhì)粒體系產(chǎn)生意外而導致出現(xiàn)具有活性的病毒的可能較大，因而被認為安全系數(shù)較低。

第三代質(zhì)粒系統(tǒng)，為避免第一代質(zhì)粒系統(tǒng)的安全風險，研究人員對第二代的三質(zhì)粒系統(tǒng)也做了進一步改進，去除了HIV病毒所有輔助因序列，HIV原有的9個基因保留3個（gag、pol、rev）于構(gòu)建的慢病毒載體中。體系產(chǎn)生意外重組的可能性很低。

第四代質(zhì)粒系統(tǒng)，也是四質(zhì)粒系統(tǒng)，這也是目前被廣泛使用的慢病毒載體系統(tǒng)。這個系統(tǒng)是在第三代三質(zhì)粒系統(tǒng)的基礎(chǔ)上改進而來的。是將env基因放在一個單獨的表達質(zhì)粒上，此外，還將tat基因去除，這樣就形成了四個質(zhì)粒的系統(tǒng)，即pGag/Pol、pRev、pVSV-G，此外，還有一個可以放置目的基因序列的載體。這個體系意外產(chǎn)生活性病毒的可能被大大降低。這類載體系統(tǒng)中含有可誘導性基因，最具代表性的為四環(huán)素-誘導系統(tǒng)，其為可調(diào)控系統(tǒng)與慢病毒載體的結(jié)合產(chǎn)物，人為地控制植入LV的目的基因的表達，使基因的條件性表達和基因敲除都成為可能，并且繼續(xù)保留了自身失活的優(yōu)勢[12-16]，為探索基因的功能提供了有利的工具。

3 慢病毒載體的優(yōu)勢和安全性

慢病毒是一類逆轉(zhuǎn)錄病毒的總稱，由慢病毒改建而來的慢病毒載體因其高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)移效率成為常用研究工具。與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，慢病毒有其獨特的優(yōu)點：①較其他逆轉(zhuǎn)錄病毒有著更廣泛的宿主，對于分裂和非分裂細胞均具有感染能力，對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導效率，使目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加。這一特性使得慢病毒載體可以用于采用基因治療方式治愈疾病的臨床試驗和研究中。比如一些神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病。在神經(jīng)系統(tǒng)中，大部分的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞處于一個相對靜止的狀態(tài)，使得其他的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對于神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病的基因治療并不適用，而實驗證實，慢病毒載體無論對于體外的組織和細胞培養(yǎng)試驗，還是體內(nèi)的基因治療實驗，對于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞都具有較高并且較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染能力[17-21]。②慢病毒載體攜帶并整合進入宿主細胞的目的基因?qū)D(zhuǎn)錄沉默作用有一定的抵抗能力，可以在靶細胞中得到持續(xù)高效穩(wěn)定的表達。③慢病毒載體中可以插入組織細胞特異性的啟動子和增強子，提高轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)錄靶向性，使慢病毒載體中的目的基因在特定的組織細胞中表達。④經(jīng)過構(gòu)建后的慢病毒載體可以攜帶大約5 kb，甚至更長的目的基因，因此除了外源的short-hairpin RNAs（shRNAs）等小分子外，很多cDNA也能被克隆進入慢病毒載體，當然隨著目的基因長度的增加，其病毒滴度也隨之下降[22-27]。由于慢病毒載體具有如上眾多的優(yōu)勢，使得慢病毒載體成為一種能實現(xiàn)外源基因的高效導入及應用于疾病的基因治療等多方面的有效工具，具有良好應用前景。

雖然慢病毒載體與其他載體相比具有以上優(yōu)勢，但也有其限制性，主要是生物安全性和病毒滴度兩方面。由于慢病毒載體主要來源為HIV病毒，特別是HIV-1應用的較為廣泛和深入，因此慢病毒的生物安全性成為使用者擔心的主要問題之一。慢病毒的分子結(jié)構(gòu)被不斷改進，主要致力于如何阻止形成有復制能力的HIV病毒，現(xiàn)在應用比較廣泛的是三質(zhì)粒、四質(zhì)粒表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)中的包裝信號被刪除，包裝序列不能整合至病毒基因組中，因此病毒感染宿主細胞后不能復制，也不會利用宿主細胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。所以我們常用的慢病毒載體中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒[9,28-32]。但是由于HIV-1慢病毒載體的自然宿主是人，則病毒仍然具有可能的潛在的生物學危險，建議不要使用編碼已知或可能會致癌的基因的假型病毒，除非已經(jīng)完全公認某個基因肯定沒有致癌性，否則均不建議采用假型病毒進行生物學實驗[33,34]。要使慢病毒基因廣泛應用于研究和臨床，還需要從以下幾點著手：一是設(shè)計載體時需要進一步縮短載體及包裝質(zhì)粒的病毒編碼序列，降低病毒基因重組的幾率；二是提高其病毒滴度，使其更加廣泛和便利的應用。

4 不同公司的慢病毒載體介紹

近幾年來，慢病毒載體因其獨特的優(yōu)勢被大家所熟知和應用。市場上暢銷的慢病毒表達載體主要來自Life Technologies、Clontech，國內(nèi)還有吉凱基因、輝駿生物、賽業(yè)生物、百恩維生物等。

Life Technologies公司的Life ViraPower Lentiviral Expression System是市場上較早的慢病毒表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)中共包含4個質(zhì)粒：一是插入pLenti表達載體，用于插入目的基因，上面包括ψ包裝信號以及截短的HIV 3’及5’LTR，便于病毒包裝；二是pLP1質(zhì)粒，表達形成慢病毒結(jié)構(gòu)所必需的gag基因以及病毒復制和整合必需的pol基因；三是pLP2質(zhì)粒，用以表達Rev蛋白，它能與pLP1上的反應元件共同作用誘導gag和pol表達，并指導病毒RNA的核運輸；四是pLP/VSVG表達VSV-G，使宿主范圍更廣。必須這4個質(zhì)粒共同作用，才能產(chǎn)生有感染能力的病毒。

現(xiàn)在該公司產(chǎn)品中應用較為廣泛的是Life TechnologiesTM在ViraPowerTM慢病毒蛋白表達系統(tǒng)基礎(chǔ)上開發(fā)的新型病毒表達系統(tǒng)——ViraPowerTMHiPerformTM慢病毒蛋白表達系統(tǒng)，其特點為高表達，高低度，快速克隆和易檢測。該系統(tǒng)中還增加了兩個元件，分別為來源于旱獺肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulation element, WPRE）和來源于HIV1整合酶基因的central Polypurine Tract（cPPT），WPRE有利于增加蛋白的表達量，而cPPT元件則有利于增加病毒的滴度，WPRE和cPPT元件能使蛋白的表達量至少提高4倍。同時，為滿足不同實驗者的實驗需求，目前Life TechnologiesTM還可提供組成型的ViraPowerTMHiPerformTM慢病毒蛋白表達系統(tǒng)，可調(diào)控外源基因表達的四環(huán)素誘導的ViraPowerTMHiPerformTM慢病毒蛋白表達系統(tǒng)以及可實現(xiàn)組織或細胞特異性表達的無啟動子的ViraPowerTMHiPerformTM慢病毒蛋白表達系統(tǒng)等。

Clontech公司的Lenti-XTMHTX Packaging System屬于第四代包裝系統(tǒng)。與Invitrogen第四代的表達載體相似，有ψ包裝信號和LTR，也有WPRE和cPPT兩個元件。不同之處是Lenti-XTMHTX表達系統(tǒng)將pol基因分離出來，使gag、pol和env成為三個獨立載體，而不是兩個載體，這意味著要產(chǎn)生原始的病毒，還需要更多的重組步驟，進一步提高了生物安全性；并且引入了四環(huán)素誘導表達技術(shù)，極大地提高了病毒包裝所需蛋白的表達量，使獲得的病毒滴度更高。則完整的系統(tǒng)包含5個載體，安全性更高。同時試劑盒中的packaging mix也有區(qū)別，Lenti-X HT包裝系統(tǒng)利用了反式激活級聯(lián)反應來高水平表達病毒蛋白。HT即high Titers的縮寫。一般來說，慢病毒表達的滴度約為105-106TU/mL，而Clontech的滴度達到108TU/mL。這就意味著不必濃縮和純化，就能直接感染細胞。Lenti-X系列還包含了熒光表達載體，使目的蛋白可以在N端或C端融合AcGFP1（綠色）或DsRed（紅色）熒光蛋白，這樣就很容易觀察到蛋白的表達和轉(zhuǎn)運。

吉凱基因也是知名度較高的慢病毒表達系統(tǒng)的公司之一。吉凱基因慢病毒載體系統(tǒng)包括GV慢病毒載體系列，pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體三個質(zhì)粒。GV慢病毒載體中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他輔助元件，例如WPRE（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element）。通常可以根據(jù)不同的實驗目的針對GV載體改造，獲得帶有特定基因序列的慢病毒顆粒，進行不同目的的實驗，以滿足不同的實驗需求。pHelper 1.0載體中含有HIV病毒的編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白的gag基因；編碼病毒特異性酶的pol基因；編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達的調(diào)節(jié)因子的rev基因。pHelper 2.0載體中含有單純皰疹病毒來源的VSV-G基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。吉凱基因慢病毒產(chǎn)品包括慢病毒包裝、慢病毒載體構(gòu)建、RNAi慢病毒、過表達慢病毒、microRNA慢病毒等?？蓾M足不同的實驗需求。

當然慢病毒載體的公司不只以上介紹的幾家，現(xiàn)在各個公司的慢病毒表達系統(tǒng)都比較成熟，各有其優(yōu)點及局限性。沒有任何一件產(chǎn)品能夠滿足所有的實驗需求，挑選哪個公司的哪種產(chǎn)品，還需要實驗人員充分了解實驗產(chǎn)品的性質(zhì)，優(yōu)點及其局限性，同時結(jié)合自己的實驗目的來選擇合適的試劑盒。

5 慢病毒載體在基因分子生物學研究中的地位和應用

慢病毒載體由于其自身優(yōu)勢，得到了越來越多的認可及應用。比如聯(lián)合RNA干擾（RNA interference, RNAi）進行實驗研究、基因治療以及細胞和動物模型建立等領(lǐng)域。

5.1 慢病毒載體介導的RNAi 在RNAi的應用過程中，慢病毒載體已被作為一個高效實用的基因轉(zhuǎn)移工具在基礎(chǔ)和應用研究領(lǐng)域得到廣泛應用[35,36]。RNAi是指正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象，在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA, dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。其利用RNA介導，特異性地阻斷和降低目的基因的表達。質(zhì)粒介導RNAi轉(zhuǎn)染率低、基因抑制表達弱、持續(xù)時間短、不適合體內(nèi)實驗等缺點，但LV-RNAi作用持久，同時載體感染細胞的范圍擴大，既可用于細胞特定基因功能的研究，還可用于基因治療，并且兩種技術(shù)的優(yōu)勢結(jié)合，已成為腫瘤性疾病治療一種全新方法，通過LV將腫瘤的治療基因安全地轉(zhuǎn)移到靶細胞內(nèi)，在骨肉瘤、白血病、肝癌、鼻咽癌等種惡性腫瘤中的基礎(chǔ)研究中均有廣泛的應用。Pfeifer等[37]利用LV與RNAi技術(shù)，將LV介導的siRNA導入小鼠受精卵中，培育后得到特定基因表達沉默的小鼠個體，用于有關(guān)疾病機制的基礎(chǔ)研究和特定基因缺失后對細胞功能的影響研究等領(lǐng)域。

5.2 在腫瘤治療中的應用 癌癥的發(fā)生主要與基因突變有關(guān)，尤其是與癌基因的激活有關(guān)，主要有基因突變、擴增和染色體重排3種激活機制?，F(xiàn)在主要通過手術(shù)、放療和化療等手段進行治療?；蛑委熥鳛橐环N新的方法正處于快速發(fā)展階段，主要途徑是把目的基因?qū)氚屑毎ａ槍δ[瘤發(fā)生發(fā)展過程中的異?；颍胗兄委焹r值的基因片段，并使其在目的細胞中有效、長久地表達，從而達到治療目的[38-42]。而LV的一些生物學特性使基因治療的設(shè)想具備了可能性。以前列腺癌細胞為研究對象，Yu等[43]把一受雄性激素調(diào)控并在前列腺特異表達的啟動子和另一EGFP基因插入LV中，并分別轉(zhuǎn)染正常細胞和前列腺癌細胞，結(jié)果只在癌細胞中有目的基因EGFP表達，且雄性激素可以促使EGFP的表達而不改變表達特異性。從以上實驗研究可以看出，如果LV應用于腫瘤疾病的臨床治療，可能會為疾病的治療帶來新的進展。

5.3 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應用 慢病毒載體能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大多數(shù)非分裂的原代細胞，包括神經(jīng)元，進而能夠持續(xù)穩(wěn)定的表達，起到治療的作用。已有大量研究工作[44-46]表明應用慢病毒載體表達多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)基因，在帕金森病、老年癡呆癥、脊髓受損等多種疾病的動物模型中進行長期治療，已取得良好的效果。Poeschla等[47]構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染于患有帕金森?。≒arkinson's disease, PD）大鼠，結(jié)果顯示可改善大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，保護并防止多巴胺神經(jīng)元退化，可起到減輕PD神經(jīng)癥狀的效果。

5.4 轉(zhuǎn)基因動物模型構(gòu)建 慢病毒載體技術(shù)是培育轉(zhuǎn)基因動物模型的有效工具之一，將目的基因轉(zhuǎn)入宿主細胞后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄、整合等，能高效地使優(yōu)勢基因在宿主體內(nèi)得到良好的表達。從而得到需要的帶有目的基因的個體。由于其操作簡單，對宿主細胞有良好的適應性，所以，慢病毒系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因動物方面有著良好的應用前景。許多情況下，這些突變動物表型與某種人類疾病的臨床癥狀類似，使這些突變動物可能成為人類疾病的理想模型，通過轉(zhuǎn)基因和基因打靶獲得的遺傳工程動物的疾病表型能在近交系中保持高度穩(wěn)定，與改變營養(yǎng)條件、藥物作用或手術(shù)途徑制備的模型相比，這些遺傳修飾動物模型具有更好的一致性和穩(wěn)定性，能夠更加真實地反映人類疾病的病理過程和分子改變[16,48-51]。無數(shù)研究[52-54]已經(jīng)證明，許多遺傳工程動物（ 如遺傳工程小鼠和小型豬） 已成為研究人類重大疾病，包括新生和重現(xiàn)傳染病、腫瘤、心血管疾病、老年性疾病、精神性疾病及遺傳病等理想的疾病動物模型，通過它們對分析人類疾病的致病機制和病因?qū)W，動物和人類行為，生物與環(huán)境相互作用，解答特定人群對某種疾病的易感性，以及研發(fā)新型特效預防和治療藥物均有重要推動作用[55,56]。

6 展望

慢病毒載體在基因轉(zhuǎn)染方面的獨特優(yōu)勢，已經(jīng)被廣泛認可。今后的研究重點，將在以下幾個方面：①進一步對慢病毒載體系統(tǒng)進行改進，或開發(fā)性的慢病毒體系，以使之適應不同的轉(zhuǎn)基因需求；②如何進一步提高病毒的滴度，以消除技術(shù)上的瓶頸；③探索將慢病毒載體直接為臨床所用時的安全性因素，以使其為患者所服務；④繼續(xù)擴展慢病毒載體的使用范圍。總之，作為一種有效的基因轉(zhuǎn)染工具，慢病毒載體具有多方面的應用前景。

2013年腫瘤學類期刊影響因子前十位期刊（按核心影響因子排名）

引自2014年科技期刊引證報告（中信所）。

排名 期刊名稱 主辦單位 核心總被引頻次 核心影響因子1 中華腫瘤雜志 中華醫(yī)學會、中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所 2,299 1.049 2 中國肺癌雜志 中國抗癌協(xié)會、中國防癆協(xié)會、天津醫(yī)科大學總醫(yī)院 1,042 0.977 3 中國腫瘤 中國醫(yī)學科學院（全國腫瘤防治研究辦公室） 1,475 0.965 4 腫瘤上海市腫瘤研究所、上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院、世界衛(wèi)生組織癌癥研究合作中心1,167 0.861 5 臨床腫瘤學雜志 解放軍第八一醫(yī)院 1,333 0.822 6 中華放射腫瘤學雜志 中華醫(yī)學會、中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院 1,251 0.795 7 中華腫瘤防治雜志 中華預防醫(yī)學會、山東省腫瘤防治研究院 2,379 0.791 8 中國癌癥雜志 復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院 1,165 0.771 9 實用癌癥雜志 江西省腫瘤醫(yī)院、江西省腫瘤研究所 1,028 0.731 10 Chinese Journal of Cancer 中山大學腫瘤防治中心 1,781 0.691