彭 暢，蔣正軒，梁 坤，陶黎明

翼狀胬肉中血管內(nèi)皮生長因子、內(nèi)皮抑素的表達以及新生血管生成情況

彭 暢1，蔣正軒2，梁 坤2，陶黎明2

目的 通過研究翼狀胬肉組織中新生血管數(shù)量、促進血管生成因子以及抑制血管生長因子的表達情況，探討翼狀胬肉組織中促進血管形成和抑制血管生成的情況。方法手術(shù)獲得正常的結(jié)膜組織35例（對照組）及翼狀胬肉組織40例（實驗組），用免疫組化及Western blot的方法分別檢測兩組樣本中新生血管密度（MVD）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、內(nèi)皮抑素（Endostatin）的表達情況。其中，CD31是標記組織MVD的指標。結(jié)果 ①免疫組化法結(jié)果顯示:在翼狀胬肉組織中MVD的含量明顯高于正常結(jié)膜組織;VEGF在正常球結(jié)膜組織中僅有少量陽性表達，在翼狀胬肉組織中陽性細胞明顯增多，著色顯著加深;翼狀胬肉組織中上皮細胞基底細胞層中的Endostatin抗原陽性表達則明顯少于正常球結(jié)膜組織。②Western blot結(jié)果顯示人正常球結(jié)膜與翼狀胬肉中VEGF及Endostatin蛋白表達存在差異。翼狀胬肉組織中VEGF蛋白/β-actin（1.46±0.59）顯著高于正常球結(jié)膜組/β-actin（0.46±0.45），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;翼狀胬肉組織中Endostatin蛋白/β-actin（0.58±0.11）顯著低于正常球結(jié)膜組/β-actin（1.54±0.12），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 在翼狀胬肉中發(fā)現(xiàn)其MVD及促血管生長因子的表達高于正常結(jié)膜組織，而血管抑制因子的表達含量降低，這一血管平衡的打破可能是翼狀胬肉的發(fā)病基礎(chǔ)之一。

翼狀胬肉;血管平衡;血管內(nèi)皮生長因子;內(nèi)皮抑素

翼狀胬肉是我國常見眼表疾病之一，為瞼裂部球結(jié)膜與角膜上的一種贅生組織，其侵犯角膜后日漸增大，甚至覆蓋瞳孔區(qū)。該病不僅嚴重影響患者的外觀，還可因其牽拉角膜作用而引起眼部不適及角膜散光，同時可不同程度地影響眼球運動，嚴重影響視力及視覺質(zhì)量［1］。目前，翼狀胬肉的發(fā)病機制尚不完全清楚。既往觀點認為翼狀胬肉是一種增生性、變性疾病。最近的研究［2］表明，翼狀胬肉主要表現(xiàn)為纖維血管組織的大量增生，且侵襲力較強，破壞了角膜緣的結(jié)構(gòu)，并侵入角膜內(nèi)呈進行性生長。因此，在翼狀胬肉發(fā)病過程中，新生血管在其中發(fā)揮了重要的作用，抑制血管生長因子和促進血管生長因子之間的平衡打破可能是該病的主要原因之一。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是重要的血管生成素之一，而內(nèi)皮抑素（Endostatin）在體外實驗中被認為是具有抑制血管內(nèi)皮細胞增生作用的因子［3］。然而，這種具有血管內(nèi)皮抑制劑作用的因子尚未在翼狀胬肉中組織中被證實。該研究利用免疫組化及Western blot的方法檢測翼狀胬肉及正常的球結(jié)膜組織中血管相關(guān)因子及新生血管的表達差異，從而進一步探索血管相關(guān)性因素在翼狀胬肉發(fā)病機制中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 標本 手術(shù)獲得40例（男19例，女21例）翼狀胬肉組織，患者平均年齡53.2歲;正常球結(jié)膜取自患有白內(nèi)障和（或）斜視疾病，而無翼狀胬肉的患者35例（男13例，女12例），平均年齡65.4歲。術(shù)前裂隙燈檢查排除所有的參與者其他角結(jié)膜性疾病，手術(shù)過程中排除由局麻藥、藥物或化學因素引起的影響。研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學倫理委員會批準，所有參加本研究的翼狀胬肉患者和對照組患者均在知情同意的前提下簽署相應(yīng)知情同意書。

1.2 試劑 鼠抗VEGF、兔抗CD31多克隆抗體、二步法免疫組化檢測試劑、DAB試劑盒、β-actin均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;兔抗血管Endostatin多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;VEGF一抗購自美國SANTA CRUZ公司;Endostatin一抗購自武漢美國Bioworld Technology公司;二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本分組 40例翼狀胬肉標本作為實驗組，35例正常球結(jié)膜組織作為對照組，兩組均采用Western blot法及免疫組化法檢測相關(guān)蛋白。

1.3.2 病理學檢查 翼狀胬肉及正常球結(jié)膜組織用10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，分別做常規(guī)組織切片，HE染色，鏡下觀察并比較各組織的病理狀況。

1.3.3 免疫組化檢測VEGF、Endostatin及CD31蛋白表達 翼狀胬肉及正常球結(jié)膜組織分別用10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，標記后切片。采用二步法染色，主要步驟如下:常規(guī)脫蠟，水化組織切片;3%過氧化氫去離子水孵育5 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗;滴加一抗，4℃過夜，PBS沖洗2 min，共3次;滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育20 min，PBS沖洗2 min，共3次;DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片觀察。在光學顯微鏡下進行染色參數(shù)分析，量化蛋白表達并做統(tǒng)計。

1.3.4 Western blot法檢測 VEGF、Endostatin 蛋白表達 每組分別取約100 mg組織，加入裂解液（1 ml組織細胞裂解液 +10 μl PMSF，剪碎并研磨組織，冰上操作，持續(xù)30 min，將組織研磨成勻漿。吸取組織勻漿于事先標記好的EP管中，4℃下12 000 r/min離心40 min，取上清液進行蛋白定量。每組取50 mg勻漿蛋白，加入10%或12%SDS上樣緩沖液，加熱后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%的脫脂奶粉室溫封閉 30 min，并分別用 VEGF（1∶200）或Endostatin（1∶250）多克隆抗體室溫孵育1 h，ECL顯色，掃描分析兩組蛋白質(zhì)表達相對含量。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料均以±s表示;定量資料用雙側(cè)t檢驗，計數(shù)資料用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 人正常球結(jié)膜與翼狀胬肉組織病理學變化

HE染色顯示:對照組表層上皮細胞排列整齊，基底上皮細胞邊界清晰，間質(zhì)少量血管;實驗組上皮層增厚，表層上皮細胞排列紊亂，細胞體積增大，基底上皮邊界模糊，間質(zhì)中大量新生血管。見圖1。

圖1 人正常球結(jié)膜與翼狀胬肉組織病理學觀察 HE×200

2.2 人正常球結(jié)膜與翼狀胬肉中VEGF、Endostatin及CD31的表達差異 免疫組化結(jié)果顯示:VEGF抗原陽性表達主要位于上皮細胞基底部及血管內(nèi)皮細胞之中，呈棕黃色分布。正常球結(jié)膜組織中僅有少量陽性表達，幾乎不可見。實驗組陽性細胞明顯增多，著色顯著加深。見圖2 A1、A2。而翼狀胬肉組織中上皮細胞基底細胞層中的Endostatin抗原陽性表達則明顯少于正常球結(jié)膜組織。見圖2 B1、B2。在實驗組中由CD31標記的新生血管為21.19±4.13，而對照組為15.12±2.99，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2 C1、C2。

圖2 人正常球結(jié)膜與翼狀胬肉中VEGF、Endostatin及CD31的表達

2.3 人正常球結(jié)膜與翼狀胬肉中VEGF及Endostatin蛋白表達變化 Western blot結(jié)果顯示:實驗組VEGF蛋白（1.46±0.59）顯著高于對照組（0.46±0.45），差異有統(tǒng)計學意義（F=6 554.72，P＜0.05）。實驗組Endostatin蛋白（0.58±0.11）顯著低于對照組（1.54±0.12），差異有統(tǒng)計學意義（F=6 352.37，P＜0.05）。見圖3。

3 討論

圖3 正常球結(jié)膜與翼狀胬肉中VEGF及Endostatin蛋白的表達

翼狀胬肉是眼科常見的慢性炎癥性病變，被認為是一種因角膜緣干細胞受損，病變的結(jié)膜組織不斷生長，最終侵入角膜，其主要表現(xiàn)為慢性充血及向結(jié)膜浸潤性生長。目前臨床主要治療方式為翼狀胬肉切除術(shù)，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高［4］。目前研究［5］顯示，新生血管在翼狀胬肉中發(fā)揮重要作用，翼狀胬肉中大量VEGF及新生血管的表達表明新生血管的發(fā)生是翼狀胬肉形成的重要機制。另一方面，具有抑制血管內(nèi)皮細胞增生作用的因子，如Endostatin蛋白的表達卻很少在翼狀胬肉組織及正常球結(jié)膜組織之間做比較，因此該研究進一步驗證血管平衡的改變在翼狀胬肉發(fā)病機制中發(fā)揮的作用。

本研究通過臨床手術(shù)獲得翼狀胬肉及正常球結(jié)膜組織，分為實驗組及對照組。HE染色顯示，與對照組相比，實驗組上皮層增厚，上皮細胞排列紊亂，細胞體積有增大趨勢，上皮基底部呈不規(guī)則樣改變，組織間質(zhì)中新生血管數(shù)量增加。這些病理改變可能與翼狀胬肉發(fā)病中增殖與凋亡的平衡被打破有關(guān)［6］;但增殖及凋亡因素不能完全解釋該病的發(fā)生，隨后的研究［4］顯示，翼狀胬肉組織中血管的異常表達可能是該病的重要發(fā)生機制之一。在新生血管的發(fā)生過程中，有兩種因素參與其中。一方面，組織中促進血管生長因子的增加有關(guān)，如VEGF［7］、成纖維細胞生長因子［8］等，其中來源于角膜成纖維細胞的VEGF，能夠促進組織毛細血管群的形成，目前被認為是新生血管生成的最重要的生長因子之一［9］。另一方面，Endostatin作為膠原Ⅹ、Ⅷ的羧基末端片段，是目前發(fā)現(xiàn)的一種強有力的血管抑制因子，能特異性抑制血管內(nèi)皮細胞增生，從而抑制血管新生。其表達情況存在于正常的皮膚組織中，而較少存在于血管豐富的異常組織中［10］。而在人類正常球結(jié)膜組織中及翼狀胬肉組織中，這一蛋白從未被檢測。

免疫組化法結(jié)果顯示對照組球結(jié)膜組織上皮細胞及血管間質(zhì)細胞中VEGF表達較少，胞質(zhì)淡染，而上皮基底細胞中Endostatin著色顯著加深，陽性表達明顯高于實驗組。然而，人類翼狀胬肉組織上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞中VEGF著色較深，而表達Endostatin蛋白的細胞數(shù)較少，且胞質(zhì)色淡。這一結(jié)果表明，翼狀胬肉中的血管平衡被打破，導(dǎo)致血管大量增生，最終引起疾病。Western blot結(jié)果均與上述一致，進一步證實了這一結(jié)論。此外，實驗組與對照組中MVD的表達同樣存在差異，表明可能由于血管平衡被打破，促進血管增加的因子增多，而抑制血管增加的因子減少，導(dǎo)致翼狀胬肉中新生血管數(shù)量明顯提高。因此，翼狀胬肉可能是由于血管失衡—VEGF表達增加，而Endostatin表達降低，最終導(dǎo)致了翼狀胬肉的發(fā)生。這一結(jié)果將為抗血管治療人類翼狀胬肉這一眼表常見疾病提供了新的理論依據(jù)。

［1］李淑琳.翼狀胬肉發(fā)病機制的研究進展［J］.眼科研究，2009，27（3）:248－52.

［2］Bradley J C，Yang W，Bradley R H，et al.The science of pterygia［J］.Br J Ophthalmol，2010，94（7）:815－20.

［3］Bai Y J，Huang L Z，Zhou A Y，et al.Antiangiogenesis effects of endostatin in retinal neovascularization［J］.J Ocul Pharmacol T-her，2013，29（7）:619－26.

［4］宋寅偉.翼狀胬肉新生血管形成機制及其治療的研究進展［J］.中華實驗眼科雜志，2012，30（2）:172－5.

［5］Todani A，Melki S A.Pterygium:current concepts in pathogenesis and treatment［J］.Int Ophthalmol Clin，2009，49（1）:21－30.

［6］Liang K，Jiang Z，Ding B Q，et al.Expression of cell proliferation and apoptosis biomarkers in pterygia and normal conjunctiva［J］.Mol Vis，2011，17:1687－93.

［7］周 舟，李瑞莊，龐燕華，等.SDF-1與VEGF在翼狀胬肉中的表達及意義［J］.山東醫(yī)學，2011，32（9）:1154－7.

［8］桑愛民，陸 宏.翼狀胬肉bFGF TNF-α p53表達的研究［J］.中國實用眼科雜志，2010，28（10）:1136－9.

［9］Liang K，Jiang Z，Zhao B，et al.The expression of vascular endothelial growth factor in mast cells promotes the neovascularisation of human pterygia［J］.Br J Ophthalmol，2012，96（9）:1246－51.

［10］Mogili N S，Krishnaswamy V R，Jayaraman M，et al.Altered angiogenic balance in keloids:a key to therapeutic intervention［J］.Transl Res，2012，159（3）:182－9.

Expressions of vascular endothelial growth factor，endostatin and microvessel density in pterygia tissues

Peng Chang1，Jiang Zhengxuan2，Liang Kun2，et al
（1Dept of Graduate School，Anhui Medical University，Hefei230032;2Dept of Ophthalmology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230601）

ObjectiveTo investigate the angiogenic imbalance in pterygium tissues of Chinese patients.MethodsForty pterygia and thirty-five normal bulbar conjunctivas were obtained.Proangiogenic and antiangiogenic factors such as vascular endothelial growth factor（VEGF）and endostatin were texted by immunohistochemical and western-blot.And microvessel density（MVD）was evaluated with immunoassaying for CD31.ResultsOur study revealed that the positive rate of VEGF significantly increased in the pterygium samples compared to the normal conjunctiva samples.Immunohistochemical staining of pterygium tissues indicated less intense staining of endostatin in pterygium comparing normal bulbar conjunctivas.And microvessel density was higher in the pterygium tissues than normal conjunctiva.ConclusionThe finding of high levels of proangiogenic factors and low levels of antiangiogenic factors in pterygia confirm that both proangiogenic and antiangiogenic factors are known to play an important role in human pterygium pathogenesis.

angiogenic balance;pterygia;vascular endothelial growth factor;endostatin

R 777.33

A

1000－1492（2014）05－0645－04

2014－02－17接收

安徽省自然科學基金項目（編號:1208085MH178）;安徽省高校自然科學基金重點項目（編號:KJ2013A147）;安徽醫(yī)科大學?；穑ň幪?2013xkj024）

1安徽醫(yī)科大學研究生學院，合肥 230032

2安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院眼科，合肥 230601

彭 暢，女，碩士研究生;

陶黎明，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail:Taolimingchina@126.com