楊建華 崔 霞 常培培 李 翠 李云洲 梁 燕

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100）

EMS誘變番茄自交系TTD302A的突變表型鑒定和分析

楊建華 崔 霞 常培培 李 翠 李云洲 梁 燕*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100）

為創(chuàng)制用于番茄遺傳育種和基因功能研究的新種質(zhì)，用0.7%的甲基磺酸乙酯（EMS）浸泡處理TTD302A種子 8 h，清水沖洗后催芽育苗，定植于塑料大棚中，單株觀察、單株留種。對(duì)M2群體進(jìn)行株系和單株的系統(tǒng)觀察，表型表現(xiàn)一致的株系混合留種，有表型變異的單株進(jìn)行單株留種，獲得M3種子。另外選取了15份出現(xiàn)典型變異性狀的M2材料進(jìn)行SSR檢測(cè)。通過(guò)對(duì)M2群體表型性狀的觀察，共發(fā)現(xiàn)373個(gè)變異性狀，297個(gè)變異單株，總的單株變異頻率為7.1%。葉、花、果實(shí)和植株的表型變異頻率依次為1.5%、2.8%、1.3%和2.4%。SSR分析結(jié)果表明9份材料在 DNA 水平上有變異。

甲基磺酸乙酯（EMS）；番茄；自交系；突變體

植物遺傳資源是作物新品種選育的重要物質(zhì)基礎(chǔ)（孫傳清 等，2001），尤其是親本資源，在雜交育種過(guò)程中比普通種質(zhì)發(fā)揮著更重要的作用。因此，運(yùn)用理化手段創(chuàng)制番茄新種質(zhì)，開展種質(zhì)創(chuàng)新途徑的基礎(chǔ)工作很有必要。甲基磺酸乙酯（EMS）是作物誘變育種中應(yīng)用最廣泛、效果最好的一種化學(xué)誘變劑（李衛(wèi)華 等，2011），與其他誘變劑相比，EMS誘變產(chǎn)生點(diǎn)突變的頻率較高，染色體畸變相對(duì)較少，且多為顯性突變體，易于篩選（安學(xué)麗 等，2003）。

目前，國(guó)內(nèi)外研究者已在擬南芥（Yong et al.，2005；Chiu et al.，2007）、玉米（Till et al.，2004）、大豆（Cooper et al.，2008）、蕪菁（Stephenson et al.，2010）等植物中利用EMS誘變技術(shù)構(gòu)建了突變體庫(kù)。在番茄 （Solanum lycopersicumL.）上，Menda等（2004）利用EMS（0.5%）和快速中子誘變加工番茄品種M82種子得到3 417個(gè)突變體，Minoia等（2010）利用兩種不同濃度的EMS（0.7%、1%）處理加工番茄品種Red Setter種子構(gòu)建突變體庫(kù)，經(jīng)TILLING技術(shù)檢測(cè)，結(jié)果表明0.7%的EMS處理和1%的EMS處理的突變體庫(kù)的突變密度分別是 1/574 kb 和 1/322 kb。Saito等（2011）利用不同濃度梯度的EMS（0.3%、0.5%、0.7%、1.0%、1.5%）和γ-射線處理Micro-Tom，篩選到1 048個(gè)突變單株。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于EMS誘變番茄種子，構(gòu)建突變?nèi)后w作為新種質(zhì)的研究還未見報(bào)道，同時(shí)，國(guó)外選用的番茄材料基本是紅果中果型加工品種（M82），或紅果小果型加工品種（Red Setter），或觀賞型Micro-Tom。本試驗(yàn)選擇配合力高、綜合性狀好的鮮食粉果大果型番茄自交系TTD302A為材料進(jìn)行EMS誘變，旨在豐富現(xiàn)有粉果大果型番茄遺傳變異類型，創(chuàng)制遺傳新種質(zhì)，為我國(guó)番茄育種和基因功能研究提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

番茄自交系 TTD302A，由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院番茄課題組提供。該品系為普通番茄，有限生長(zhǎng)型，果實(shí)粉色，大小均勻，單果質(zhì)量為250 g，配合力高，綜合性狀良好。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子誘變處理 2012年3月，挑選2 200粒當(dāng)年采收的TTD302A的飽滿種子，室溫浸種10 h，濾紙吸干水后浸泡于0.7%的EMS-磷酸緩沖液（pH 7.0）中（崔霞 等，2013），4℃ 靜置 2 h，37℃ 130 r·min-1振蕩處理 6 h，用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗 6 h 后，轉(zhuǎn)至鋪有濕潤(rùn)雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于人工培養(yǎng)箱28℃催芽。以磷酸緩沖液處理100粒種子作為對(duì)照。

1.2.2 突變?nèi)后w構(gòu)建 催芽3 d后將發(fā)芽種子播于穴盤育苗，4月中旬，定植于西北農(nóng)林科技大學(xué)南校區(qū)新天地塑料大棚內(nèi)，M1單株留種。2013年1月，每個(gè)M2株系選取20粒種子進(jìn)行浸種催芽，穴盤育苗，3月下旬定植于楊凌農(nóng)業(yè)創(chuàng)新園日光溫室內(nèi)，分別對(duì)每個(gè)株系和株系內(nèi)每個(gè)單株進(jìn)行系統(tǒng)觀察和性狀記載。對(duì)表現(xiàn)一致的株系混合留種，對(duì)有變異的單株進(jìn)行單株留種（圖1）。

1.2.3 DNA提取 DNA提取方法參照孫亞?wèn)|（2012）的改良CTAB法。

圖1 EMS誘變番茄種子構(gòu)建突變?nèi)后w流程

表1 用于SSR標(biāo)記的引物名稱

1.2.4 SSR-PCR檢測(cè) 用于番茄SSR標(biāo)記的11對(duì)引物（表1）參照孫亞?wèn)|（2012）的文獻(xiàn)。PCR反應(yīng)體系為 20 μL：10μL Mix，正反向 SSR 引物各 1 μL（10 ng·μL-1），2 μL DNA 模板（50 ng·μL-1）， 補(bǔ)充ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性 1 min；50～60℃（根據(jù)引物退火溫度而定）退火 1 min，72 ℃ 延伸 2 min，共 40 個(gè)循環(huán)；4℃ 保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 M1群體的表型變異

經(jīng)0.7%的EMS處理8 h的2 200粒M1種子發(fā)芽931粒，出苗656株，成活633株，發(fā)芽率、出苗率和成活率分別為42.3%、29.8%和28.8%。通過(guò)田間觀察，在M1群體中發(fā)現(xiàn)182個(gè)在莖葉、花器官和果實(shí)等部位發(fā)生明顯變異的單株，最后獲得358個(gè)M2株系的種子，可育率為56.6%（有種子的植株數(shù)/成活的植株總數(shù)）。

2.2 M2群體的表型變異

通過(guò)對(duì)M2群體的358個(gè)株系共4 191個(gè)單株的系統(tǒng)觀察，發(fā)現(xiàn)373個(gè)在葉形態(tài)、葉色、花色、花形態(tài)、果形、果大小、株型和育性等方面的變異性狀，參照Menda等（2004）、李錫香和杜永臣（2008）對(duì)變異性狀進(jìn)行分類（表2）。這373個(gè)變異性狀出現(xiàn)在297個(gè)變異單株上，總的單株變異頻率為7.1%（表型變異植株數(shù)/群體植株總數(shù)），其中在葉、花、果實(shí)和植株發(fā)生的變異性狀數(shù)分別為66、126、81和100，依次占總變異性狀數(shù)的17.69%、33.78%、21.72% 和26.81%。有50個(gè)單株同時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上變異性狀（圖 2）。

圖2 突變單株上的突變性狀數(shù)分布

表2 EMS誘變TTD302A M2群體突變表型分類

2.2.1 M2群體葉片表型變異 M2群體有63個(gè)單株出現(xiàn)葉片表型變異，變異頻率為1.5%（突變單株/總單株數(shù)）。對(duì)照的葉片表現(xiàn)為綠色，二回羽狀復(fù)葉，葉片平展，裂刻中等（圖3-a）。M2群體葉片變異主要發(fā)生在葉片顏色和葉片形態(tài)上，顏色變異有黃色葉（圖3-b）、黃綠色葉、顏色嵌合葉、淺綠色葉（圖3-e）、深綠色葉（圖3-f）。黃綠色葉變異有兩種表現(xiàn)形式，即新生葉黃綠，老葉綠色（圖3-c-1）和老葉黃綠，新生葉綠色（圖3-c-2）。顏色嵌合葉變異表現(xiàn)兩種類型，即白綠嵌合（圖3-d-1）和白黃綠嵌合（圖3-d-2）。在黃色葉、黃綠色葉和顏色嵌合葉中，除了白綠色嵌合突變株在整個(gè)生育期一直穩(wěn)定表現(xiàn)外，其余的只出現(xiàn)在苗期，變異色會(huì)隨著生育期的推進(jìn)逐漸恢復(fù)為正常葉色（綠色）。

形態(tài)變異有卷葉、細(xì)長(zhǎng)葉、寬葉、多小葉、少小葉及萎蔫葉。卷葉變異表現(xiàn)葉邊緣朝葉面內(nèi)卷，葉脈彎曲（圖3-g）。細(xì)長(zhǎng)葉變異表現(xiàn)為葉片及小葉變窄變細(xì)，裂刻深，個(gè)別單株的葉脈延伸出葉尖，長(zhǎng)出長(zhǎng)須（圖3-h）。寬葉變異是由于葉片從普通葉型突變成薯葉型（圖3-i）。多小葉變異表現(xiàn)小葉多，比對(duì)照正常植株多出30個(gè)小葉，整片葉變大（圖3-j），無(wú)小葉變異表現(xiàn)小葉少，葉邊緣平滑，裂刻淺，整片葉變?。▓D3-k）。萎蔫葉表現(xiàn)呈失水萎蔫狀，葉片小且綠（圖3-l）。

圖3 葉片突變體

2.2.2 M2群體花器官表型變異 M2群體在花器官上發(fā)生變異的單株有117個(gè)，變異頻率為2.8%?；ㄆ鞴僮儺愔饕憩F(xiàn)在花冠、花柱、花萼和花序等幾個(gè)方面。對(duì)照的花冠有6個(gè)花瓣，底部相互粘連，尖部向后彎曲，顏色為黃色。M2群體中花冠主要在顏色和形態(tài)上發(fā)生變異，顏色變異有淺黃色（圖4-a）、橘黃色（圖4-b）和白化（圖4-c）?；ü诎谆瘍H表現(xiàn)在花瓣邊緣，后期開的花不表現(xiàn)白化。形態(tài)變異有花冠變大（圖4-d）、花冠變?。▓D4-e）、花瓣細(xì)長(zhǎng)、花瓣卷曲和花瓣畸形?；ò昙?xì)長(zhǎng)主要表現(xiàn)花瓣之間分離，且變窄變細(xì)（圖4-f）?；ò昃砬憩F(xiàn)為花瓣向后卷曲將花萼包裹（圖4-g）。花瓣畸形表現(xiàn)為花瓣破裂，不完整（圖4-h）。

對(duì)照的花柱表現(xiàn)為雄蕊包裹柱頭，柱頭與雄蕊近等長(zhǎng)，單圓花柱，顏色為綠色。M2群體中花柱出現(xiàn)的變異有黃柱頭（圖4-i）、多子房、雄蕊開裂、柱頭分裂、長(zhǎng)柱頭和短柱頭等。柱頭表現(xiàn)黃色的植株果實(shí)轉(zhuǎn)色前顏色均為綠白，同時(shí)部分植株葉片顏色為淺綠。多子房的突變體表現(xiàn)為在中央大子房的外圍著生一圈小子房，5～6個(gè)（圖4-j）。雄蕊開裂突變伴隨柱頭外露（圖4-k），不利于受精，最終部分突變體表現(xiàn)不育。柱頭分裂出現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上柱頭（圖4-l）。長(zhǎng)柱頭和短柱頭突變表現(xiàn)為柱頭長(zhǎng)于或短于雄蕊3～4 mm（圖4-m，n）。

對(duì)照的花萼稍短于花瓣，花萼與花瓣相互分離。M2群體花萼突變有長(zhǎng)花萼（圖4-o）、短花萼（圖4-p）、花萼退化?；ㄝ嗤嘶袃煞N表現(xiàn)形式，一種為花萼與花瓣粘連（圖4-q-1），另一種是花萼直接退化消失（圖4-q-2）。

圖4 花器官突變體

2.2.3 M2群體果實(shí)表型變異 M2群體果實(shí)變異單株55個(gè)，變異頻率為1.3%。對(duì)照果實(shí)轉(zhuǎn)色前為綠色，成熟后果色為粉色，圓形，無(wú)果面棱溝，單果質(zhì)量為 250 g（圖 5-a、e）。M2群體果實(shí)在轉(zhuǎn)色前的變異有轉(zhuǎn)色前出現(xiàn)綠白（圖5-b）、深綠（圖5-c）、果面綠條紋（圖5-d-1），轉(zhuǎn)色前綠白和深綠的果實(shí)成熟后表現(xiàn)正常果色粉色，果面綠條紋在果實(shí)成熟后轉(zhuǎn)變成橙黃色條紋，且條紋面積減少（圖5-d-2）。成熟果的變異有大果（圖5-f）、小果、果頂開裂、高圓（圖5-i）等。最大果單果質(zhì)量為372 g，小果單果質(zhì)量都在100 g以下，最小果單果質(zhì)量?jī)H為39 g，小果同時(shí)表現(xiàn)為果面棱深，果實(shí)扁圓（圖5-g），一般難收獲到種子。果頂開裂（圖5-h），一般開裂得較規(guī)則，裂成2～4瓣，成熟后裂口處果肉變軟易附生霉菌。

2.2.4 M2群體植株表型變異 M2群體植株變異單株共100個(gè)，變異頻率為2.4%。植株變異主要表現(xiàn)在育性和植株形態(tài)兩方面。育性變異有植株不開花（圖6-a）和雄性不育（圖6-b）兩種表現(xiàn)形式，不開花植株同時(shí)表現(xiàn)植株葉片卷曲。株型變異有有限變無(wú)限 （圖6-c）、植株矮小、葉腋分化能力強(qiáng)、多毛體、無(wú)頭苗、多頭苗等。植株矮小表現(xiàn)為葉小，花小，節(jié)間短（圖6-d）。葉腋分化能力強(qiáng)表現(xiàn)為葉腋處長(zhǎng)出巨芽（這種變異現(xiàn)象和番茄的巨芽病很相似，側(cè)芽很大）（圖6-e）和花序（圖6-f），部分花可結(jié)果（圖6-g）。多毛突變體表現(xiàn)為莖葉茸毛長(zhǎng)密，在植株生長(zhǎng)點(diǎn)茸毛最多（圖6-h）。無(wú)頭苗（圖6-i）、多頭苗（圖6-j）僅在苗期出現(xiàn)，后期發(fā)育恢復(fù)成正常株型。

圖5 果實(shí)突變體

圖6 植株整株突變體

2.3 M2群體典型變異單株的SSR分析

圖7 SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

利用11對(duì) SSR引物對(duì)在葉、花和果實(shí)部位發(fā)生典型變異性狀的 15份植株 DNA 通過(guò) PCR 擴(kuò)增和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行差異條帶檢測(cè)（圖7），通過(guò)對(duì)其中存在的差異條帶進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)9份材料在 DNA 水平上有變異（表3）。

表3 M2表型變異植株的SSR分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

EMS濃度是影響突變體有效產(chǎn)生的重要參數(shù)，濃度設(shè)置要引起一定致死度，在M2得到相對(duì)較高的突變率，也要減小M1的不育率，使表型突變體能正常留種。根據(jù)崔霞等（2013）的研究結(jié)果，0.7%的EMS能減少TTD302A種子30%的相對(duì)發(fā)芽率，比 0.7%EMS 減少 Red Setter 20% 的相對(duì)發(fā)芽率要高。M2單株變異頻率為7.1%，僅為Micro-Tom的一半，但是M1的可育率為56.6%，遠(yuǎn)大于Micro-Tom 的 34.5%（Saito et al.，2011）。致死度、可育率以及表型突變率的不同，可能主要是由于材料的遺傳背景不同，導(dǎo)致對(duì)同濃度的EMS反應(yīng)不同，Red Setter和Micro-Tom都是栽培種，重組率高，本試驗(yàn)選擇的自交系高度純合，突變位點(diǎn)相對(duì)較少，隨之發(fā)生在生殖代謝過(guò)程的點(diǎn)突變也較少，導(dǎo)致突變率低而可育率高。

本試驗(yàn)利用EMS處理番茄種子，出現(xiàn)了很多表型變異體，有許多與前人報(bào)道過(guò)的形態(tài)突變體相似。例如578-5表現(xiàn)葉片卷曲皺縮，墨綠色，且節(jié)間縮短，與突變體dump（Koka et al.，2000）相似；300-5葉片邊緣向葉面內(nèi)卷，與突變體flacca（Bowman et al.，1984）相似；298-1、649-5 葉腋分生能力強(qiáng)，葉腋處著生花，且結(jié)果，與突變體wiry（Kim，2003）相似。還有很多突變表現(xiàn)可能與某些基因有關(guān)，如113株系從有限生長(zhǎng)突變成無(wú)限生長(zhǎng)，可能與基因self-pruning（sp）（Pnueli et al.，1998）突變有關(guān)；231-7 整個(gè)葉片大，裂刻深，小葉多，葉形復(fù)雜，可能與LeT6（Janssen et al.，1998）、PHAN（Kim，2003）、KNOX1（Bharathan et al.，2002）等多個(gè)基因的表達(dá)有關(guān)。EMS引起變異的機(jī)理主要是引起G烷基化，從而使烷基化的G取代C與T配對(duì)，導(dǎo)致G/C到A/T的替換，容易引起等位基因突變，所以推測(cè)以上表型變異出現(xiàn)的原因，可能是某一基因具有多效性，或者是多個(gè)基因緊密連鎖形成一個(gè)單位控制這些復(fù)雜性狀。

總的來(lái)說(shuō)，化學(xué)誘變比自然突變的變異頻率要大得多，可有益突變頻率 仍然較低。本試驗(yàn)確實(shí)獲得了一些具有某些優(yōu)良變異表型的材料，SSR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證明在DNA水平也產(chǎn)生了變異，如雄性不育突變體，為減少番茄雜交種制種工作量提供了寶貴材料。植物育種需要有對(duì)作物改良有利的遺傳變異性狀，EMS誘變能產(chǎn)生大量突變體，對(duì)出現(xiàn)的突變體的變異性狀進(jìn)行定向選擇，經(jīng)M3及后代驗(yàn)證為穩(wěn)定遺傳后，可以對(duì)具有重要農(nóng)藝性狀的突變體進(jìn)行鑒定，作為遺傳改良和表型標(biāo)記的全新種質(zhì)。

本試驗(yàn)利用EMS誘變鮮食粉果大型番茄進(jìn)行了有益嘗試，并取得了較好結(jié)果，獲得297個(gè)M2突變單株，涵蓋莖葉、花和果實(shí)等植物器官，總的單株變異頻率為7.1%。今后，一方面在繼續(xù)對(duì)目前誘變得到的突變體進(jìn)行分子檢測(cè)的基礎(chǔ)上，對(duì)已經(jīng)檢測(cè)出能遺傳變異且表型穩(wěn)定的突變體盡快進(jìn)入應(yīng)用研究程序；另一方面，可以選用更大的誘變?nèi)后w，構(gòu)建鮮食粉果大果型番茄突變體庫(kù)，為育種和基因功能研究創(chuàng)建基礎(chǔ)材料。

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Identification and Analysis of Mutant Phenotype Tomato Inbred Line TTD302A Induced with EMS

YANG Jian-hua，CUI Xia，CHANG Pei-pei，LI Cui，LI Yun-zhou，LIANG Yan*

（CollegeofHorticulture，NorthwestAgriculture&ForestryUniversity，Yangling712100，Shaanxi，China）

To create new tomato（Solanum lycopersicumL.）germplasm applied both to genetic modified breeding and functional genomics research on tomato，this study treated the seeds of TTD302A with 0.7% EMS for 8 h，then washed them by flowing water. M2seeds were harvested from each plant independently in M1generation. Afterwards，the agronomic traits and biological characters of each plant were both investigated and recorded in M2generation at seedling stage，flowering fruit period and mature period，respectively. The leaves DNA of all mutation plants were extracted，of which 15 materials expressing typical variation characteristics were selected for SSR molecular marker detection. Finally we harvested M3seeds from single plant expressing character mutation separately. Through observation on M2group characters，we found 373 mutant characters and 297 mutant plants in total. The rate of all M2phenotype mutation added up to 7.1%. It could be found that the mutation population contained abundant mutation types appearing in leaf，floral organ，fruit and plant. Their mutation rates were 1.5%，2.8%，1.3%，2.4%，respectively. The results of SSR analysis indicated that 9 materials had mutation in DNA level.

Ethyl methane sulfonate （EMS）；Tomato；Inbred line；Mutant

楊建華，碩士研究生，專業(yè)方向：番茄誘變育種，E-mail：yangjianhua227@sina.cn

*通訊作者（Corresponding author）：梁燕，博士，教授，專業(yè)方向：番茄遺傳育種與蔬菜種質(zhì)資源，E-mail：liangyan@nwsuaf.edu.cn

2013-11-21 ；接受日期： 2014-01-15

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目 （2011KTCL02-03）