薛小艷 劉世琦 郭會(huì)平 孫亞麗 于新會(huì) 連海峰

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

秋水仙素注射大蒜花苞誘導(dǎo)四倍體的研究

薛小艷 劉世琦*郭會(huì)平 孫亞麗 于新會(huì) 連海峰

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

為獲得染色體加倍的大蒜植株，用0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的秋水仙素注射蒼山糙蒜和金蒜3號(hào)的花苞，并在不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)花苞內(nèi)形成的氣生鱗莖，當(dāng)再生體系建立后，對(duì)根尖進(jìn)行倍性鑒定。結(jié)果表明，MS基本培養(yǎng)基添加0.05 mg·L-1NAA和2.0 mg·L-1KT能誘導(dǎo)較多的氣生鱗莖萌發(fā)，直徑4～5 mm的氣生鱗莖萌發(fā)率最高，且蒼山糙蒜氣生鱗莖的萌發(fā)率整體比金蒜3號(hào)高。秋水仙素注射花苞后，金蒜3號(hào)的花苞死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蒼山糙蒜。隨著秋水仙素濃度增大，花苞內(nèi)形成氣生鱗莖數(shù)不斷降低，染色體加倍率升高。蒼山糙蒜以0.20%秋水仙素濃度處理下四倍體誘導(dǎo)率最高，為7.69%；金蒜3號(hào)以0.15%秋水仙素濃度處理下四倍體誘導(dǎo)率最高，為11.76%。

大蒜花苞；氣生鱗莖；組織培養(yǎng)；四倍體；秋水仙素

大蒜（Allium sativumL.）有性雜交困難，自然變異有限，多倍體育種成為無(wú)性繁殖大蒜作物改良品種的有效途徑之一（郭瑞峰和咸豐，2011）。秋水仙素（colchicine）可通過(guò)抑制或破壞紡錘體的形成，使細(xì)胞不能分裂，但姐妹染色單體仍能最終分開(kāi)，并進(jìn)一步重組成一個(gè)染色體數(shù)目加倍的細(xì)胞核的途徑誘導(dǎo)染色體加倍（周明龍，2012），因而作為較為理想的多倍體誘變劑廣泛使用（Sun et al.，2009；Kulkarni & Borse，2010）。秋水仙素通常采用浸種、滴涂和注射生長(zhǎng)點(diǎn)等方法誘導(dǎo)植物無(wú)性階段產(chǎn)生多倍體（Takamura & Miyajima，1996；郭啟高 等，2000）。

大蒜氣生鱗莖是由蒜薹上花托的小鱗芽發(fā)育而成，通常每個(gè)花苞原基可形成10～40個(gè)氣生鱗莖（張素芝和李紀(jì)蓉，2006；馬雯 等，2011）。氣生鱗莖體積小，數(shù)量多，帶病毒程度低，易發(fā)育成獨(dú)立的試管苗（張素芝和李紀(jì)蓉，2006）。相關(guān)研究表明，以氣生鱗莖為外植體的大蒜愈傷組織途徑或不定芽途徑的組織培養(yǎng)再生體系均可獲得染色體加倍效果，但不定芽途徑的植株再生報(bào)道相對(duì)較少且存在技術(shù)障礙（馬雯 等，2011；袁學(xué)軍和李艷麗，2011）。

本試驗(yàn)以大蒜花苞為試驗(yàn)材料，通過(guò)秋水仙素注射花苞腔的方法，研究了秋水仙素對(duì)花苞及形成氣生鱗莖數(shù)的影響，并采用不定芽途徑離體組織培養(yǎng)法將花苞內(nèi)形成的氣生鱗莖培養(yǎng)成試管苗，以期獲得四倍體大蒜植株，為大蒜多倍體誘導(dǎo)育種和新種質(zhì)的創(chuàng)新提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大蒜品種蒼山糙蒜和金蒜3號(hào)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 秋水仙素對(duì)田間大蒜花苞的注射處理 大蒜于2012年10月5日種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站，采用常規(guī)水肥管理。于2013年5月6日大蒜抽薹花苞初期，用秋水仙素對(duì)花苞腔進(jìn)行注射處理：每個(gè)品種共處理80株花苞，分7：00、16：00兩批，采用濃度為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%的秋水仙素注射花苞腔內(nèi)原基生長(zhǎng)點(diǎn)，每次注射0.1 mL，每天1次，連續(xù)注射3次，對(duì)照用清水處理，3次重復(fù)。于2013年5月27日采收花苞內(nèi)形成的氣生鱗莖，于4℃貯藏15 d后進(jìn)行大蒜氣生鱗莖萌發(fā)的組織培養(yǎng)及再生植株的倍性鑒定。

1.2.2 氣生鱗莖室內(nèi)組織培養(yǎng)的植株再生 將用清水處理、4℃貯藏15 d的氣生鱗莖剝皮，用75%酒精消毒30 s，無(wú)菌水沖洗3次，4%次氯酸鈉消毒35 min，無(wú)菌水沖洗3次，將其接種于不同誘芽培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽萌發(fā)，計(jì)算氣生鱗莖萌發(fā)率。

設(shè)置3種培養(yǎng)基進(jìn)行誘芽培養(yǎng)基配方的篩選。1 號(hào)培養(yǎng)基：MS+NAA 0.05 mg·L-1+BA 0.1 mg·L-1（馬雯 等，2011）；2 號(hào)培養(yǎng)基：MS+NAA 2.0 mg·L-1+ BA 6.0 mg·L-1（張素芝和李紀(jì)蓉，2006）；3號(hào)培養(yǎng)基：MS+NAA 0.05 mg·L-1+KT 2.0 mg·L-1。培養(yǎng)基添加30 g·L-1蔗糖和 7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0，121℃滅菌 20 min。

將用秋水仙素處理、4℃貯藏15 d的氣生鱗莖剝皮，將其接種于3號(hào)培養(yǎng)基中，研究氣生鱗莖粒子大小對(duì)萌發(fā)率的影響。之后繼續(xù)在3號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成再生植株。組培室培養(yǎng)條件為：（25±1）℃，光照強(qiáng)度 60 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間 16 h·d-1。

1.2.3 根尖染色體數(shù)目的鑒定 將組培苗培養(yǎng)60 d后，視組培苗的生根情況，取1～2 cm的根，參照文獻(xiàn)（朱徽，1982；饒小珍 等，2003；孫奇 等，2011）進(jìn)行預(yù)處理、固定、解離、染色。以及鏡檢的方法，經(jīng)多次試驗(yàn)篩選出了適宜大蒜根尖染色體計(jì)數(shù)的直接壓片鑒定法。

取氣生鱗莖培養(yǎng)所得小苗的粗壯根系，每株取1～2個(gè)生長(zhǎng)旺盛的根尖，在25℃飽和對(duì)二氯苯水溶液中預(yù)處理3 h，然后用現(xiàn)配制的卡諾固定液（無(wú)水乙醇∶冰乙酸=3∶1）在4℃下固定30 min，在95%酒精、85%酒精和70%的酒精中依次洗滌20 min后，放入70%的酒精中保存于4 ℃冰箱中待用；制片時(shí)，水洗凈根尖后，用1 mol·L-1的鹽酸在60℃條件下解離8 min，倒出鹽酸，再加清水浸洗3次，最后放于清水中30 min后染色；染色時(shí)，切取根尖2～3 mm置于載玻片中，加1滴卡寶品紅染液，染色5 min后，蓋上蓋玻片，壓片，在熒光顯微鏡下觀察染色體數(shù)目。

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 DPS 6.55 和 Excel 2003 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)氣生鱗莖萌發(fā)率的影響

由表1可知，不同培養(yǎng)條件下氣生鱗莖萌發(fā)率差異極顯著。氣生鱗莖在3號(hào)培養(yǎng)基（MS+NAA 0.05 mg·L-1+KT 2.0 mg·L-1）萌發(fā)率最高，蒼山糙蒜萌發(fā)率高達(dá)75.91%，金蒜3號(hào)萌發(fā)率高達(dá)63.59%。

表1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)氣生鱗莖萌發(fā)率的影響

圖1 大蒜氣生鱗莖在不同培養(yǎng)基上的發(fā)育狀況

氣生鱗莖在1號(hào)培養(yǎng)基上發(fā)育異常，從根部產(chǎn)生芽，不適宜氣生鱗莖的正常萌發(fā)（圖1-a、A）；氣生鱗莖在2號(hào)培養(yǎng)基上發(fā)育正常，部分根部產(chǎn)生芽，部分莖尖發(fā)芽，有部分氣生鱗莖正常萌發(fā)（圖1-b、B）；氣生鱗莖在3號(hào)培養(yǎng)基上發(fā)育正常，莖尖發(fā)芽，適于氣生鱗莖的正常萌發(fā)（圖1-c、C）。

2.2 粒子大小對(duì)氣生鱗莖萌發(fā)率的影響

無(wú)菌條件下，將氣生鱗莖培養(yǎng)于3號(hào)培養(yǎng)基上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氣生鱗莖萌發(fā)不僅受培養(yǎng)環(huán)境的影響，還受氣生鱗莖粒子大小的影響。粒子較小和較大都不利于氣生鱗莖的萌發(fā)，粒子直徑4～5 mm時(shí)，氣生鱗莖萌發(fā)率最高，且蒼山糙蒜的氣生鱗莖萌發(fā)率整體比金蒜3號(hào)高（圖2）。

2.3 大蒜氣生鱗莖組織培養(yǎng)條件下的發(fā)育變化

無(wú)菌條件下，將氣生鱗莖接種于3號(hào)培養(yǎng)基（圖3-a、A）上；培養(yǎng) 7～10 d 后莖尖轉(zhuǎn)綠（圖 3-b、B）；約經(jīng)過(guò) 20 d，莖尖發(fā)芽（圖 3-c、C）；60 d后生根成苗（圖3-d、D）。

圖2 粒子大小對(duì)氣生鱗莖萌發(fā)率的影響

圖3 大蒜氣生鱗莖的植株再生

2.4 秋水仙素對(duì)花苞及形成氣生鱗莖數(shù)的影響

由表2可知，秋水仙素注射花苞后，金蒜3號(hào)的花苞死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蒼山糙蒜，且隨著秋水仙素濃度的增大，花苞內(nèi)形成的氣生鱗莖數(shù)隨之減少，直徑4～5 mm蒼山糙蒜氣生鱗莖粒子率隨之有所降低，直徑4～5 mm金蒜3號(hào)氣生鱗莖粒子率先升高后降低?？梢?jiàn)秋水仙素通過(guò)影響粒子直徑大小間接影響了氣生鱗莖的萌發(fā)率。

2.5 秋水仙素對(duì)蒼山糙蒜和金蒜3號(hào)的倍性誘導(dǎo)效應(yīng)

由表3可以看出，0.15%秋水仙素注射蒼山糙蒜花苞對(duì)染色體加倍的誘導(dǎo)率低于金蒜3號(hào)，不同濃度秋水仙素處理的氣生鱗莖的倍性變化規(guī)律基本一致，即隨著秋水仙素濃度增大，二倍體率降低，嵌合體率升高，四倍體率也升高（0.20%秋水仙素處理金蒜3號(hào)除外）。蒼山糙蒜以0.20%秋水仙素濃度下四倍體誘導(dǎo)率最高，為7.69%；金蒜3號(hào)以0.15%秋水仙素濃度下四倍體誘導(dǎo)率最高，為11.76%。

表2 秋水仙素對(duì)花苞及形成氣生鱗莖的影響

表3 秋水仙素對(duì)花苞內(nèi)氣生鱗莖的誘導(dǎo)變異

由圖4可以看出用根尖壓片法鏡檢觀察染色體條數(shù)，氣生鱗莖得到的小苗，不僅有16條染色體的二倍體植株（圖4-a）和32條染色體的四倍體植株（圖4-c），還有一些嵌合體（圖4-b）。

圖4 二倍體、嵌合體和四倍體植株的染色體

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)不同培養(yǎng)基配方篩選發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的MS培養(yǎng)基對(duì)氣生鱗莖的萌發(fā)影響較大。氣生鱗莖在1號(hào)培養(yǎng)基（MS+NAA 0.05 mg·L-1+BA 0.1 mg·L-1） 上 發(fā) 育 異 常， 從根部產(chǎn)生芽，不適宜氣生鱗莖的正常萌發(fā)；氣生鱗莖在 2 號(hào)培養(yǎng)基（MS+NAA 2.0 mg·L-1+BA 6.0 mg·L-1）上部分發(fā)育正常，莖尖發(fā)芽，但正常萌發(fā)率較低。這與張素芝和李紀(jì)蓉（2006）、馬雯等（2011）的研究結(jié)果有所不同，可能是因?yàn)榇笏馄贩N間有差異，對(duì)氣生鱗莖的萌發(fā)造成不同的影響。氣生鱗莖在 3號(hào)培養(yǎng)基（MS+NAA 0.05 mg·L-1+ KT 2.0 mg·L-1）培養(yǎng)條件上發(fā)育正常，莖尖發(fā)芽，正常萌發(fā)率最高，蒼山糙蒜萌發(fā)率達(dá)75.91%，金蒜3號(hào)萌發(fā)率達(dá)63.5%。2個(gè)品種間萌發(fā)率的差異可能是由于品種間差異造成的，比如生理休眠期因素（陳沁濱 等，2007）。

大蒜氣生鱗莖萌發(fā)不僅受培養(yǎng)環(huán)境的影響，還受粒子大小的影響。粒子較小和較大都不利于氣生鱗莖的萌發(fā)，粒子直徑為4～5 mm時(shí)，萌發(fā)率最高。不同大小的氣生鱗莖萌發(fā)率差異很大，這與氣生鱗莖的休眠情況不同有關(guān)。較小的氣生鱗莖由于種皮障礙，成熟度差，休眠程度高，不易打破（楊期和 等，2003）。較大的氣生鱗莖發(fā)育較早，進(jìn)入了生理休眠期，需滿足冷溫需求量才能解除休眠（徐紅艷 等，2013）。直徑4～5 mm的氣生鱗莖，未受到種皮障礙，也未進(jìn)入生理休眠期，尚處于養(yǎng)分積累和鱗莖形成期，其體內(nèi)物質(zhì)代謝旺盛，極易萌發(fā)。

采用秋水仙素注射蒼山糙蒜和金蒜3號(hào)花苞，二者均獲得了一定頻率的四倍體試管苗。經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，秋水仙素注射金蒜3號(hào)的花苞死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蒼山糙蒜，這可能是因?yàn)榻鹚?號(hào)花苞和蒼山糙蒜花苞對(duì)秋水仙素的敏感程度不同所致。秋水仙素的毒害性較大，如果處理不當(dāng)，不僅無(wú)法使植物細(xì)胞染色體加倍，還會(huì)對(duì)處理材料造成嚴(yán)重的毒害作用，甚至使處理材料死亡，對(duì)誘變效率有較大的影響（鄭永強(qiáng)和徐坤，2003）。因此需要針對(duì)不同材料篩選合適的處理濃度。

蒼山糙蒜以0.20%秋水仙素濃度下四倍體誘導(dǎo)率最高，為7.69%；金蒜3號(hào)以0.15%秋水仙素濃度下四倍體誘導(dǎo)率最高，為11.76%。此次試驗(yàn)獲得了四倍體大蒜植株，為大蒜多倍體誘導(dǎo)育種和新種質(zhì)創(chuàng)新提供了新的途徑。

秋水仙素注射花苞，形成的氣生鱗莖經(jīng)組織培養(yǎng)獲得試管苗，用根尖壓片法鏡檢觀察染色體條數(shù)，發(fā)現(xiàn)不僅有16條染色體的二倍體植株和32條染色體的四倍體植株，還有一些染色體重復(fù)加倍或有絲分裂不平衡造成的嵌合體。由于大蒜屬于無(wú)性繁殖作物，有性繁殖困難，導(dǎo)致其遺傳背景狹窄，新品種選育困難，獲得的嵌合體材料可通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行大量繁殖，為大蒜新品種選育提供新的途徑（徐啟江 等，2008）。

目前，大蒜多倍體誘導(dǎo)主要通過(guò)人工途徑中的化學(xué)方法，包括活體誘導(dǎo)法和離體誘導(dǎo)法。與經(jīng)離體誘導(dǎo)的多倍體相比，直接處理生長(zhǎng)點(diǎn)使其萌發(fā)的活體誘導(dǎo)法具有操作簡(jiǎn)單且適于推廣的優(yōu)點(diǎn)，但其多倍體誘導(dǎo)率較離體誘導(dǎo)法低。采用直接注射花苞腔初期不定芽生長(zhǎng)點(diǎn)與注射隱匿于貯藏葉中的生長(zhǎng)點(diǎn)相比，誘導(dǎo)效果更好，但誘變劑的選取，處理材料，誘變劑濃度﹑劑量及處理技術(shù)環(huán)節(jié)上還有待于進(jìn)一步探索與完善（溫艷斌和程智慧，2012）。

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Studies on Tetraploid Induction of Garlic Bud by Colchicine Injection

XUE Xiao-yan，LIU Shi-qi*，GUO Hui-ping，SUN Ya-li，YU Xin-hui， LIAN Hai-feng

（CollegeofHorticultureScienceandEngineering，ShandongAgriculturalUniversity，StateKeyLaboratoryofCropBiology，KeyLaboratoryofBiologyandGeneticImprovementofHorticulturalCrop（HuanghuaiRegion），MinistryofAgriculture，Tai’an271018，Shandong，China）

In order to acquire tetraploid garlic（Allium sativumL.），diploid garlic buds were injected with 0.05%，0.10%，0.15% and 0.20% colchicine，respectively．Then the aerial bulbils in garlic buds were cultured in MS medium combined by different growth regulators．After a regeneration system was constructed，polyploid appraisal was conducted on the root tip．The result indicated that more aerial bulbils were able to germinate on the MS basic culture medium adding 0.05 mg·L-1NAA and 2.0 mg·L-1KT．The aerial bulbils with 4-5 mm diameter had the highest germination rate．The germination rate of ‘Cangshancaosuan’ bulbils was higher than that of ‘Jinsuan No.3’．When the garlic buds were injected with colchicines，the mortality of ‘Jinsuan No.3’ bud was much higher than that of ‘Cangshancaosuan’．The number and size of the formed aerial bulbils were decreased and the rate of doubled chromosome was increased along with the increase of colchicine concentration．The highest doubling rate of ‘Cangshancaosuan’ was obtained by the treatment of injecting the buds with colchicine concentration at 0.20%，and its induction rate was 7.69%．The highest doubling rate of ‘Jinsuan No.3’ was obtained by injecting the buds with colchicine concentration at 0.15%，then its induction rate could reach the highest - 11.76%．

Garlic bud；Aerial bulbil；Tissue culture；Tetraploid；Colchicine

薛小艷，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：蔬菜栽培生理與分子生物學(xué)，E-mail：xuelinyan@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：劉世琦，教授，博士生導(dǎo)師，專(zhuān)業(yè)方向：蔬菜栽培生理與分子生物學(xué)，E-mail：liusq99@sdau.edu.cn

2013-10-17；接受日期：2013-12-03

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD01B04）