李洪軍,肖建青,2,程金蓮,劉 荷,鐘小娟,易 旻,賀建武,劉祝祥,陳義光

(1.吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院,湖南 吉首 416000;2.酒鬼酒股份有限公司,湖南 吉首 416000)

德夯嗜鹽耐鹽菌抗菌活性篩選和系統(tǒng)發(fā)育*

李洪軍1,肖建青1,2,程金蓮1,劉 荷1,鐘小娟1,易 旻1,賀建武1,劉祝祥1,陳義光1

(1.吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院,湖南 吉首 416000;2.酒鬼酒股份有限公司,湖南 吉首 416000)

以8個敏感菌株作為指示菌，采用瓊脂擴散法，對分離自湖南省德夯峽谷(28°15′～28°43′ N,109°30′～109°45′ E)普通非鹽環(huán)境土壤樣品中的294株嗜鹽及耐鹽細菌進行抗菌活性篩選，并對其中具有較強抗菌活性的菌株進行基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析.受試菌株中有109株的發(fā)酵產(chǎn)物具有抗菌活性(陽性率37.1%)，其中5個菌株具有較強抗菌活性(JSM 102030，JSM 102052，JSM 102054，JSM 102066，JSM 102082).基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這5個菌株分別屬于細菌域(Eubacteria)的3個門(Actinobacteria,Firmicutes,Proteobacteria)中的3個科(Bacillaceae,Halomonadaceae,Nocardiopsaceae)的4個屬，菌株JSM 102030屬于Halobacillus屬，與該屬已知種Halobacillus trueperi DSM 10404T的系統(tǒng)發(fā)育關系最為密切(序列相似性為99.1%)，JSM 102052和JSM 102054屬于Halomonas屬，與Halomonas alkaliphila 18bAGT的系統(tǒng)發(fā)育關系最為密切(序列相似性為98.3%)，JSM 102066屬于Nocardiopsis屬，與其系統(tǒng)發(fā)育關系最為密切的是Nocardiopsis prasina DSM43845T(序列相似性為99.3%)，JSM 102082與Oceanobacillus屬的Oceanobacillus kimchii X50T以99.6%的16S rRNA基因序列相似性聚在一起.研究結(jié)果表明，分離自湖南省德夯峽谷普通非鹽環(huán)境土樣的嗜鹽及耐鹽細菌中存在較高比例的抗菌活性菌株，且這些細菌具有較為豐富的系統(tǒng)發(fā)育多樣性.

普通非鹽環(huán)境；嗜鹽菌；耐鹽菌；抗菌活性篩選；系統(tǒng)發(fā)育分析

極端微生物(Extremophile)是指那些在一般生物不能生存的條件下(如極酸極堿、極熱極冷、高鹽、高壓等)能夠生存的微生物[1].地球上存在著大量自然形成或者人工形成的鹽域環(huán)境，如自然形成的死海等水環(huán)境和鹽土環(huán)境，以及人工形成的如鹽場、鹽池、鹽腌制食品等.自然界高鹽環(huán)境的不同，其離子組成和鹽濃度具有較大差異，這是由于形成過程和所處地質(zhì)情況造成的.生活在這些高鹽環(huán)境中的動植物種類較為有限，而以處于不同類群的微生物，如綠藻、嗜鹽古菌和嗜鹽及耐鹽的細菌等為其主要生命形式[2].而嗜鹽菌(Halophile)就是在海洋、鹽湖、鹽場以及腌制食品等高鹽環(huán)境中生存的一種微生物[3].嗜鹽及耐鹽菌具有特殊的生理機制、奇特的環(huán)境適應模式以及獨特的基因類型，使其不僅在存在的環(huán)境中對物質(zhì)的自然轉(zhuǎn)化發(fā)揮著重要作用，而且在高鹽堿性污水處理過程中也表現(xiàn)出較大的應用前景，其分泌的相關酶類在工業(yè)中也有較為廣泛的應用[2].嗜鹽及耐鹽菌的生物活性多樣性及其物質(zhì)化學結(jié)構(gòu)的獨特性，吸引人們利用該類微生物開發(fā)新型抗生素和新藥前體物質(zhì)[4].中國擁有廣闊的鹽環(huán)境和豐富的嗜鹽耐鹽微生物資源，近年來中國學者對這些微生物資源進行了研究，并篩選出一批具有較強生物活性的菌株[5-7].然而，Echigo A等[8]在日本東京周邊地區(qū)的果園、草坪等普通非鹽環(huán)境土壤中分離出176株能耐受20%(質(zhì)量體積比)NaCl的芽胞桿菌科(Bacillaceae)嗜鹽或耐鹽細菌，并發(fā)現(xiàn)其中有15株代表潛在新類群(potential novel taxa).目前，國內(nèi)對普通非鹽環(huán)境土壤中的嗜鹽及耐鹽微生物的分離和抗菌活性篩選的研究鮮見報道.

湖南省吉首市德夯峽谷(28°15′～28°43′ N,109°30′～109°45′ E)地處湘西土家族苗族自治州首府吉首市境內(nèi)，與鳳凰、花垣、保靖3縣交界，位于武陵山南支脈的南端，為云貴高原—江南丘陵的過渡地帶.總面積252 km2，是湖南省著名的風景旅游區(qū)和國家地質(zhì)公園[9-10].地質(zhì)構(gòu)造屬中國東部新華夏系構(gòu)造亞帶的一部分，地貌屬湘西北強烈上升侵溶蝕的中低山區(qū)南端，境內(nèi)多陡坡峭壁，多條溪流穿梭于其間，呈半封閉式的“V”形峽谷，深達數(shù)百米，山原破碎，地形復雜，為典型的喀斯特巖溶峽谷景觀.該地年均氣溫16～17 ℃，無霜期215～286 d，全年日照1 400 h左右，年降雨量1 200 ～1 600 mm，土壤多為石灰?guī)r發(fā)育而成的山地黃壤，屬于普通非鹽環(huán)境土壤.因其獨特的地理位置、地貌和復雜多樣自然環(huán)境條件，境內(nèi)孕育并保存了豐富的生物多樣性[11].

筆者近年對該地區(qū)普通非鹽環(huán)境土樣中的嗜鹽及耐鹽微生物資源進行一系列的調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)其中可培養(yǎng)嗜鹽及耐鹽菌存在較為豐富的多樣性.文中報道了對分離自德夯峽谷普通非鹽環(huán)境土樣中的嗜鹽及耐鹽細菌(含放線菌)的抗菌活性篩選結(jié)果，并對部分陽性菌株進行了基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，以期為該類微生物資源的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 主要儀器和試劑 離心機購自德國Eppendorf公司(5810R)，顯微鏡購自Leica公司(DM 3000)，PCR儀購自BIO-RAD公司(PE-9600)；PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；其他試劑和儀器同文獻[6].

1.1.2 主要培養(yǎng)基 (1)斜面培養(yǎng)基(Marine Agar 2216,MA)：蛋白胨5.0 g，酵母膏1.0 g，NaCl 19.45 g，MgCl25.9 g，Na2SO43.2 g，CaCl21.9 g，復合鹽A液20 mL，復合鹽B液1 mL，瓊脂20.0 g，水1 L，pH值7.5～7.8.其中復合鹽A液為檸檬酸鐵5 g，KCl 27.5 g，Na2CO38 g，水1 L；復合鹽B液為SrCl 34 g，KBr 80 g，H3BO322 g，Na2SiO34 g，(NH4)2SO41.6 g，Na2HPO48 g,水1 L.(2)液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，牛肉膏2 g，甘露醇5 g,CaCO31 g，NaCl 20 g，其他成分同斜面培養(yǎng)基，pH值7.5～7.8.(3)液體(搖瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，酵母膏1.0 g，大豆粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，NaCl 20.0 g，CaCO31.0 g，復合鹽A液20 mL，復合鹽B液1 mL，水1 L,pH值7.5～7.8.(4)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient agar,NA):蛋白胨10.0 g,牛肉膏3.0 g,NaCl 5.0 g,瓊脂15.0 g,水1 L,pH值7.2～7.5.

1.1.3 菌株來源 實驗菌株共294株，是本室用添加5%～20% NaCl的Marine Agar 2216 (MA)等高鹽培養(yǎng)基分離自德夯峽谷的森林、耕作區(qū)及溪流等非鹽環(huán)境土壤.抗菌活性篩選用的8株敏感指示菌分別是革蘭陽性菌(枯草芽胞桿菌(BacillussubtilisATCC 6051)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25922)、藤黃八疊球菌(SarcinaluteaGCMCC 1.880))、革蘭陰性菌(大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 128)、產(chǎn)氣桿菌(EnterobacteraerogenesATCC 8724)、變形桿菌(ProteusvulgarisATCC 8427))、真菌(白色念珠菌(CandidaalbicansNCPC 1027)和黑曲霉(AsperillusnigerNCPC 1003)).

1.2方法

1.2.1 抗菌活性初篩 用5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基洗下一支新鮮斜面菌體，接種于裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角錐形瓶中，28 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)96 h.發(fā)酵液5 000 r/min離心10 min，取上清液用標準的瓊脂擴散法[12]測定其抗菌活性.重復3次，指示菌平板28 ℃培養(yǎng)48 h，記錄抑菌結(jié)果.

1.2.2 抗菌活性復篩 用5 mL液體種子培養(yǎng)基洗下一支初篩抗菌活性陽性菌株新鮮斜面菌體，將菌體接種到裝有50 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角錐形瓶中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h.取種子液10 mL(按10%接種量)接入裝有90 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角錐形瓶中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)96 h.再按1.2.1所述方法進行抗菌活性實驗.

1.2.3 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 按文獻[13]中使用的方法對具有較強抗菌活性的菌株進行基因組DNA提取和16S rRNA基因擴增，寄給生工生物工程(上海)有限公司完成測序.擴增和測序使用1對細菌通用引物：正向引物8-27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1523-1504r(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′).所得序列提交國際公共數(shù)據(jù)庫GenBank保存并獲得序列號，用EzTaxon-e[14]提供的數(shù)據(jù)庫和在線軟件進行序列相似性計算，并調(diào)出相似性較高的菌株的16S rRNA基因序列；使用CLUSTAL_X軟件進行基因序列多重比對[15]，運用MEGA 4.0軟件[16]采用鄰接法(Neighbor-Joining方法)[17]進行聚類分析及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.重復取樣1 000次進行自展值分析，以評估進化樹的穩(wěn)定性[18].

1.2.4 表型特征 分別采用不同質(zhì)量體積比(0%，1%，3%，5%，7%，10%，15%，20%)NaCl的相應培養(yǎng)基平板測定實驗菌株對鹽的耐受性.菌落特征、細胞形態(tài)和生理生化特征按文獻[19]的方法進行觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1抗菌活性篩選

2.1.1 初篩 對294株實驗菌株進行抗菌活性初篩.統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液至少對1株指示菌有抗菌活性的菌株共有109株，陽性率37.1%，其中對黑曲霉(48株)和金黃色葡萄球菌(29株)具有較高抗菌活性(見表1).

表1 分離自德夯峽谷非鹽土樣的菌株抗菌活性篩選結(jié)果統(tǒng)計

2.1.2 復篩 對初篩得到的109株抗菌活性陽性菌株進行復篩.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有5株菌 (JSM 102030,JSM 102052,JSM 102054,JSM 102066,JSM 102082)發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性較強、抗菌譜較廣(見表2).

表2 德夯峽谷非鹽土樣分離菌株抗菌活性復篩結(jié)果 /mm

注 “-”表示陰性.

2.2抗菌活性陽性菌株表型特征

對5株抗菌效果較好的菌株進行菌落特征、細胞顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特征等觀察(見表3).結(jié)果表明：5個株菌中3株為革蘭氏陽性菌，2株為革蘭氏陰性菌；這些菌株的NaCl耐受范圍較廣(在0%～15%內(nèi))，最適生長鹽度范圍為3%～7%(質(zhì)量體積比)NaCl(見表3)，5株菌均為中度嗜鹽菌[2].

表3 抗菌活性較強的5個株菌部分表型特征

注 “+”表示陽性；“-”表示陰性；“W”表示弱陽性；酪素和吐溫-80水解均為陰性.

2.3基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

對5個抗菌活性較強的菌株進行16S rRNA基因序列測定、相似性搜索、序列多重比對和進化樹構(gòu)建等系統(tǒng)發(fā)育分析.結(jié)果表明，這5個菌株類群多樣性較高，分屬于3個門(Actinobacteria,Firmicutes,Proteobacteria)中的3個科(Bacillaceae,Halomonadaceae,Nocardiopsaceae)的4個屬.菌株JSM 102030屬于Halobacillus屬(Firmicutes門Bacillaceae科)，與該屬已知種Halobacillus trueperi的典型菌株(Type strain)DSM 10404T的系統(tǒng)發(fā)育關系最為密切(序列相似性為99.1%)；JSM 102052和JSM 102054同屬于Halomonas屬(Proteobacteria門Halomonadaceae科)，與Halomonas alkaliphila 18bAGT的系統(tǒng)發(fā)育關系最為密切(序列相似性為98.3%)；JSM 102066屬于Nocardiopsis屬(Actinobacteria門Nocardiopsaceae科)，與其系統(tǒng)發(fā)育關系最為密切的是Nocardiopsis prasina DSM43845T(序列相似性為99.3%)；JSM 102082與Firmicutes門Bacillaceae科Oceanobacillus屬的Oceanobacillus kimchii X50T以99.6%的16S rRNA基因聚在一起(見圖1).

圖1 基于16S rRNA基因序列的5株具有較強抗菌活性菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)從普通環(huán)境中分離篩選新的活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的難度日益上升[7].目前，微生物及其活性物質(zhì)的篩選急需擴大范圍，即不僅要繼續(xù)發(fā)掘特殊生境下土壤的微生物資源(例如沙漠及高原地帶、高鹽堿環(huán)境、溫泉等)，還要分離和篩選植物內(nèi)生菌，開發(fā)和應用海洋及極地微生物等資源，這是微生物研究的必然趨勢[20-23].

文中研究結(jié)果表明，從湖南省吉首市德夯峽谷普通非鹽環(huán)境土樣中分離的294株菌中，有109株菌的發(fā)酵液具有對1種以上敏感指示菌有抗菌活性，其中5株菌株(JSM 102030,JSM 102052,JSM 102054,JSM 102066,JSM 102082)的發(fā)酵產(chǎn)物具較強的抗菌活性，其抗菌譜較廣.系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，5株抗菌活性較強的菌株類群多樣性較高，屬于3個門(Actinobacteria,Firmicutes,Proteobacteria)中的3個科(Nocardiopsaceae,Bacillaceae,Halomonadaceae)的4個屬(Nocardiopsis,Halobacillus,Oceanobacillus,Halomonas).本研究的結(jié)果說明，從德夯峽谷普通非鹽環(huán)境土樣中分離得到的的嗜鹽和耐鹽細菌具有較高比例能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的菌株，有一定的開發(fā)潛力.筆者前期研究[24-25]和本研究的結(jié)果都說明，從普通非鹽環(huán)境土樣中的耐鹽和嗜鹽微生物中篩選抗菌活性菌株是發(fā)現(xiàn)抗菌物質(zhì)產(chǎn)生菌的途徑之一.

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(責任編輯 陳炳權)

ScreeningandPhylogeneticAnalysisofAntibiotic-ProducingHalophilicandHalotolerantBacteriafromtheDehangCanyoninHunanChina

LI Hongjun1,XIAO Jianqing1,2,CHENG Jinlian1,LIU He1,ZHONG Xiaojuan1,YI Min1,HE Jianwu1,LIU Zhuxiang1,CHEN Yiguang1

(1.College of Biology and Environmental Sciences,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China;2.Jiugui Liquor Co.Ltd.,Jishou 416000,Huana China)

The antimicrobial activity of the fermentation brothes of 294 halophilic and halotolerant bacteria,isolated from ordinary non-saline soils collected from the Dehang Canyon (28°15′～28°43′ N,109°30′～109°45′ E) in Hunan Province,China,was screened using the agar diffusion method employing 8 indicator microorganisms (three Gram-positive bacteria,three Gram-negative bacteria and two fungi).The results showed that,out of 294 strains tested,109 were positive in antimicrobial activity (37.1%),in which 5 strains exhibited strong antimicrobial activity.Then these 5 strains were submitted for 16S rRNA gene amplification and phylogenetic analysis after phenotypic characterization including morphological,biochemical and physiological tests.The results suggested that these 5 strains were members of 4 genera in 3 families (Bacillaceae,Halomonadaceae,Nocardiopsaceae) of 3 phyla (Actinobacteria,Firmicutes,Proteobacteria):strain JSM 102030 belonged to the genusHalobacillus(Firmicutes,Bacillaceae),being most closely to the type strain of Halobacillus trueperi (sequence similarity 99.1%);strains 102052 and JSM 102054 were members of the genusHalomonas(Proteobacteria,Halomonadaceae),being related most closely to the type strain of Halomonas alkaliphila (98.3%);strains JSM 102066 strain JSM 2155017 belonged to the genusNocardiopsis(Actinobacteria,Nocardiopsaceae),exhibiting 99.3 % 16S rRNA gene sequence similarity to Nocardiopsis prasina DSM43845T;strain JSM 102082 belonged to the genusOceanobacillus(Firmicutes,Bacillaceae),exhibiting 99.6% 16S rRNA gene sequence similarity to Oceanobacillus kimchii X50T.

ordinary non-saline environment;halophilic bacteria;halotolerant bacteria;antimicrobial activity;phylogenetic analysis

1007-2985(2014)06-0073-05

2014-07-25

國家自然科學基金資助項目(31460004，30970007)；湖南省重點學科建設資助項目(JSU071312Z01)；湖南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃(201208Z01)

李洪軍(1978—)，男，湖南漣源人，吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院碩士生，主要從事微生物資源與生態(tài)研究

陳義光(1965—)，男，湖南新化人，吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院教授，碩士生導師，主要從事微生物資源與生態(tài)研究.

Q9393.92

B

10.3969/j.issn.1007-2985.2014.06.018