張勝娟，夏文彤，楊曉輝，張庭廷

(安徽師范大學 生命科學院，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點實驗室，安徽 蕪湖 241000)

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六種食用油對銅綠微囊藻的抑制效應

張勝娟1，夏文彤2，楊曉輝3，張庭廷4

(安徽師范大學 生命科學院，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點實驗室，安徽 蕪湖 241000)

通過對藻密度、抑制率等相關參數(shù)的測定，分別研究了金龍魚食用油、大豆油、花生油等6種常見食用油對銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa Kutz.)生長的影響.實驗結(jié)果表明，金龍魚食用油能有效抑制銅綠微囊藻的生長，并具有明顯的劑量-效應關系，一定時間范圍內(nèi)的時間-效應關系.而3.0×105cells/ml的銅綠微囊藻，其半抑制濃度(EC50)最高可達4.18ml/L.

銅綠微囊藻；金龍魚食用油；脂肪酸；抑藻效應

近年來，隨著城市化和工業(yè)化的快速發(fā)展，大量生活和工業(yè)廢水被排入江河湖泊，導致了淡水水體的富營養(yǎng)化，每至春夏之際，藻類水華頻繁爆發(fā)，而水華藻類極易腐敗，不僅能降低水體的含氧量，還能釋放大量毒素，對人類淡水資源和水生生物的生存環(huán)境造成嚴重破壞[1].因此，如何有效控制水華藻類是維護人類生存環(huán)境的重大課題之一.淡水水華主要是藍藻，而藍藻中最常見的銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)是藍藻水華的主要元兇[2].銅綠微囊藻是一種單細胞藻類，屬藍藻門、微囊藻屬，它所產(chǎn)生的藻毒素能夠致癌，可嚴重威脅野生動植物及人類健康[3].

目前，利用化感物質(zhì)治理水華是水華治理的主要研究方向.化感物質(zhì)是水生植物生長過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，一般能在自然環(huán)境中降解，不會在生態(tài)系統(tǒng)中長期積累[4]，故其生態(tài)安全性良好.迄今為止，發(fā)現(xiàn)的化感物質(zhì)按照其化學結(jié)構(gòu)可以分成5大類：脂肪族、芳香族、含氧雜環(huán)化合物、類萜和含氮化合物[5].其中脂肪酸作為一種重要化感物質(zhì)，存在于許多植物的根莖葉中，在控制藍藻水華過程中發(fā)揮著重要作用.Yasushi[6]等(2003)證明長鏈脂肪酸能夠強烈抑制羊甲綠芽藻(Selenastrumcapricornutum)正常生長.Ikawa等[7](1984)發(fā)現(xiàn)C14-C18脂肪酸對綠藻(Chtorellapyrenoidosa)的生長也具有強烈的抑制作用；Zhang等[8](2008)從普生輪藻中分離出亞油酸、軟脂酸和豆蔻酸，并發(fā)現(xiàn)它們均有不同程度的抑藻效應；同時還研究了17種不同碳鏈長度、不同飽和程度脂肪酸類物質(zhì)的抑藻作用；發(fā)現(xiàn)各種脂肪酸均有一定的抑藻效應，抑藻活性與脂肪酸的結(jié)構(gòu)有關；不飽和脂肪酸比飽和脂肪酸的抑藻效應好，不飽和程度越高，抑藻效應越明顯；飽和脂肪酸中碳鏈越短，化感抑藻效應越強.

為此，本實驗所選用的材料是以脂肪酸為主要成分的食用油類，即金龍魚食用油、大豆油、山茶油、花生油、芝麻油、菜籽油，這些油從天然植物中提取，對環(huán)境相對安全無毒，不會造成諸如化學試劑抑藻所帶來的二次污染及生態(tài)毒性.實驗研究對象為水華常見藻類——產(chǎn)毒銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)，擬通過研究分析上述6種常見食用油對產(chǎn)毒銅綠微囊藻生長的影響，尋找出抑藻效應強的食用油.為進一步開發(fā)生物除藻劑提供理論與實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1實驗材料

實驗中使用的6種食用油分別選定為：金龍魚食用調(diào)和油(金龍魚集團有限公司產(chǎn)品)、大豆油(中糧艾地盟糧油工業(yè)有限公司產(chǎn)品)、山茶油(金華市金山油脂有限公司產(chǎn)品)、壓榨花生油(山東魯花集團有限公司產(chǎn)品)、芝麻油(北京金亭建鑫食用油有限公司產(chǎn)品)、菜籽油(江蘇紅蜻蜓油脂有限責任公司產(chǎn)品)，以上材料均購于沃爾瑪超市，所有食用油均為一級油.

實驗藻種銅綠微囊藻FACHB-942(MicrocystisaeruginosaFACHB-942)由中國科學院武漢水生所淡水藻種庫提供.

1.2實驗儀器

Motic數(shù)碼顯微鏡(德國Motic有限公司)；血球計數(shù)板(上海精密儀器儀表有限公司)；微孔過濾器，0.22μm微孔濾膜(上海興亞凈化材料廠)；注射器(上海中鴿注射器有限公司)；光照培養(yǎng)箱PGX-250B(寧波海曙賽福實驗儀器廠)；架物托盤天平(上海斗門五金工具有限公司)；電子天平FA1104(上海精密科學儀器有限公司)；無菌操作臺(新加坡ESCO有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠).

1.3藻種培養(yǎng)

在無菌條件下，向已經(jīng)高溫濕熱滅菌的250ml錐形瓶內(nèi)加入100ml的BG-11培養(yǎng)基[9]，加入銅綠微囊藻藻種，搖勻后放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).培養(yǎng)條件為:溫度24±2℃，光周期12L/12D，光照強度4000lx.每天振蕩搖勻4-5次，實驗前7天，對銅綠微囊藻進行擴大培養(yǎng)，每天加入新鮮培養(yǎng)基，使之處于對數(shù)生長期.

1.4抑藻實驗

使用0.22μm微孔過濾器，分別對實驗材料：金龍魚食用油、大豆油、山茶油、花生油、芝麻油、菜籽油進行過濾以除去微生物，置于無菌環(huán)境中備用.在無菌條件下，取處于對數(shù)生長期的銅綠微囊藻，用已滅菌BG-11培養(yǎng)基稀釋藻液，使得銅綠微囊藻液的藻密度為3.0×105cells/ml.

分別取出已稀釋的藻液40ml加入100ml錐形瓶中，再加入各種待測試的食用油，使得各種油的最終濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0ml/L.另外設置一個空白對照組，即只含相同藻密度的藻液；每組三個平行，置于1.3相同條件下進行培養(yǎng)，實驗期為8天，每隔48h用血球計數(shù)板統(tǒng)計藻細胞數(shù).

1.5對銅綠微囊藻生長影響的參數(shù)測定

1.5.1 藻密度 通過對藻細胞的計數(shù)來反映食用油對銅綠微囊藻生長的影響，每隔48h統(tǒng)計藻細胞1次，算出當天的藻細胞密度，連續(xù)計數(shù)8天.

1.5.2 抑制率與半抑制濃度 6種食用油對銅綠微囊藻的抑制百分率(Inhibition Ratio)公式為：IR(%)=(1-N/N0)×100%，其中：IR——抑制率；N——處理組的銅綠微囊藻的藻密度(cells/ml)；N0——對照組的銅綠微囊藻的藻密度(cells/ml)；將各浸提液的濃度及殺藻劑的用量與相應處理組生長抑制率做一元線性回歸，求出半抑制濃度EC50(ml/L).

1.5.3 比增長率 銅綠微囊藻的比增長率的計算公式：μ=Ln(Xn/X=(n-1)/(tn-tn-1)，其中μ為比增長率；Xn、Xn-1分別為當天和2天前的銅綠微囊藻的藻密度；tn、tn-1分別對應于Xn、Xn-1的培養(yǎng)時間.

1.6統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用Excel2003軟件和SPSS13.0軟件處理，相關統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，P<0.05表示有顯著性差異；P<0.01表示有極顯著性差異.

2 結(jié)果與分析

2.16種食用油對銅綠微囊藻生長的影響

圖1顯示的是6種食用油對銅綠微囊藻藻密度的影響.各處理組在2d內(nèi)變化不大，從4d后開始表現(xiàn)出不同的變化趨勢.金龍魚食用油處理組從0.2ml/L—8.0ml/L，每個處理組的藻細胞生長曲線均低于同期對照組生長曲線，隨處理時間增加，藻密度和同期對照組差距越大；觀察各濃度的處理組藻密度變化情況，可發(fā)現(xiàn)濃度越高，藻細胞密度越低；而其他5種食用油處理組各組生長曲線與同期對照組相比較，差距并不明顯，甚至有些濃度處理組的藻密度還高于對照組；這可能是因為這5種食用油對銅綠微囊藻并沒有明顯的抑制作用；綜合比較6種食用油對銅綠微囊藻生長的影響，可以發(fā)現(xiàn)金龍魚食用油對銅綠微囊藻有較明顯的抑制作用，且濃度與抑制效果正相關.

◇:ck,□:0.5ml/L,△:1.0ml/L,×:2.0ml/L,○:4.0ml/L,+:8.0ml/L,

圖1 金龍魚食用油(A)、大豆油(B)、山茶油(C)、花生油(D)、芝麻油(E)、菜籽油(F)對銅綠微囊藻藻細胞密度的影響
Fig 1 The effect of the edible oil of Golden dragon fish(A)、soybean oil(B)、camellia oil(C)、peanut oil(D)、sesame oil(E)、rapeseed oil(F)on algae cell density of M.aeruginosa.

2.2金龍魚食用油對銅綠微囊藻比增長率的影響

表1顯示的是金龍魚食用油對銅綠微囊藻比增長率的影響，與同期對照組比較，金龍魚食用油的各處理組比增長率均低于同期對照組，隨著處理時間延長，比增長率較對照組越低，在第8天8.0ml/L處理組出現(xiàn)了負增長.說明金龍魚食用油能明顯抑制銅綠微囊藻藻細胞的分裂和生長，濃度越高抑制效果越明顯.

表1 金龍魚食用油對銅綠微囊藻比增長率的影響Table 1 The effect of the edible oil of Golden dragon fish on specific growth rate of M.aeruginosa

*與同期對照組比較，P<0.05；**與同期對照組比較，P<0.01

2.3金龍魚食用油對銅綠微囊藻生長的抑制率

表2顯示,金龍魚食用油各處理組隨處理時間的增加，抑制率明顯升高，比較同期各處理組的抑制率，還可發(fā)現(xiàn)濃度越高，抑制率越高，8.0ml/L處理組在第8天抑制率達70%左右，說明金龍魚食用油對銅綠微囊藻有明顯的抑制作用，且濃度與抑制率正相關,說明金龍魚食用油能明顯抑制銅綠微囊藻的正常生長.

表2 金龍魚食用油對銅綠微囊藻的抑制率(%)Table 2 The inhibition ratio of the edible oil of Golden dragon fish on M.aeruginosa(%)

2.4金龍魚食用油抑制銅綠微囊藻生長的半抑制濃度

EC50按照第8天計算，由于只有金龍魚食用油對銅綠微囊藻的抑制率達到了50%以上，而其他5種食用油的抑制率并沒有達到50%，所以只計算金龍魚食用油的半抑制濃度，計算結(jié)果為4.18ml/L.

3 討論

脂肪酸是一類重要的化感物質(zhì)，有很強的抑藻作用[11-12].但本研究所用的原料是6種食用油，由于食用油均為飽和或不飽和脂肪酸所形成的甘油三酯，相對來說，游離的脂肪酸含量較低，其抑藻效果遠不如游離脂肪酸的解釋可能是脂肪酸中的主要官能團——羧基形成了酯鍵，使其化學性質(zhì)發(fā)生了改變，因此，本研究所得結(jié)果可為是利用脂肪酸還是利用其形成的酯類化合物進行抑藻提供理論參考.而在6種食用油中，其它5種食用油均為單一油類，只有金龍魚食用調(diào)和油是多種油的復合制劑，相對來說，其成分更多樣化，而且其脂質(zhì)中各種飽和程度不同的脂肪酸比例為飽和脂肪酸：單不飽和脂肪酸：多不飽和脂肪酸是111，因此在對銅綠微囊藻的抑制作用中，可能起到協(xié)同抑藻的效果，這一推測與張庭廷等[12]的研究結(jié)果相似.

此外，6種食用油均是從相應植物體提取出來的含脂肪酸的脂類物質(zhì)，將它們加入培養(yǎng)基之后，這種培養(yǎng)基物理性質(zhì)的改變，特別是其粘滯性對微囊藻的生長基本不會產(chǎn)生多大影響(加入食用油的量較小)，而真正的影響可能來源于食用油中的脂肪酸對藻細胞產(chǎn)生的一系列連鎖反應.

關于脂肪酸的抑藻機理也有一些報道.張庭廷等[11]認為脂肪酸通過自由基的鏈鎖反應，引起藻細胞膜脂質(zhì)過氧化，導致MDA的積累，大分子核酸或蛋白質(zhì)受到損傷，細胞膜通透性增加，葉綠素a合成減少，從而抑制藻細胞的生長，最終導致藻細胞破裂死亡.Wu等[13]認為脂肪酸改變藻細胞膜結(jié)構(gòu)，造成K+外泄，誘發(fā)了對藻類的抑制效應.Sokolov等[14]認為脂肪酸改變了細胞膜超微結(jié)構(gòu)或膜內(nèi)的離子通道，從而引起細胞死亡.Agafonov等[15]報道長鏈C16-C22之間的飽和脂肪酸與Ca2+的親和作用引發(fā)了抑藻效應.Igarashi等[16]認為脂肪酸通過Ca2+通道影響鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶(CaM激酶)活性，進而影響磷酸酶活性，最終抑制藻類生長.

另外，食用油雖然能夠有效抑制銅綠微囊藻的生長，但其效果卻不是最理想的.油脂類在水體中的溶解性很低，即使加入量極少也會在水面出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象，雖然是安全無毒害卻也影響水體環(huán)境的美觀.因此，以食用油抑制藻類生長在實際應用中將存在局限性.若想利用天然的油類抑藻可能要對其進行適當處理，在保持其天然特性的同時使其游離脂肪酸增加，從而增加其抑藻效能，這也是今后需要進一步探討的內(nèi)容.

然而，直接用食用油進行抑藻的研究還是首次，本研究為利用脂肪酸及其脂類抑藻提供了一些新的認識和實驗依據(jù).以食用油抑藻其優(yōu)點是成本相對較低，純天然，較人工合成的脂肪酸類可能會對環(huán)境更友好.脂肪酸類物質(zhì)是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，有著很好的生態(tài)安全性.因此利用脂肪酸類化感物質(zhì)的特性進行抑藻，將對未來水華的治理有著重要意義.不足之處是耗損了糧食資源.同時，用脂肪酸抑藻時水體表面常有油狀物漂浮，影響景觀.如何才能減少食用油的使用，增加其溶解性，減少或消除其在水面的漂浮，提高其抑藻效果，這將是有待進一步解決的問題.

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TheInhibitionEffectsofSixKindsofEdibleOiltoMicrocystisAeruginosa

ZHANG Sheng-juan1, XIA Wen-tong2, YANG Xiao-hui3, ZHANG Ting-ting4

(The Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province, College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)

Through the determination of related parameters, such as algal density, inhibition rate and so on, this article respectively studied 6 kinds of common edible oil, for example, the golden dragon fish cooking oil, soybean oil, peanut oil, etc., in order to research their influence to the growth of microcystis aeruginosa Kutz. The experimental results show that the golden dragon fish oil can effectively inhibit the growth of Microcystis aeruginosa. Simultaneously, it also has obvious dose-effect relationship, time-effect relationship within a certain period of time. And the half inhibitory concentration (EC50) of 3.0×105cells/ml microcystin algae is up to 4.18ml/L.

microcystis aeruginosa; golden dragon fish oil; fatty acid; inhibitory effect on alga;

2014-05-07

國家自然科學基金(31170443).

張勝娟(1985-)，女，河南民權人，碩士研究生.通訊作者：張庭廷(1955-)，女，安徽東至人，教授，博士.

張勝娟，夏文彤，楊曉輝，等.六種食用油對銅綠微囊藻的抑制效應[J].安徽師范大學學報：自然科學版，2014，37(6)：564-568.

X524

：A

：1001-2443(2014)06-0564-05