盧萍平，邢 鳳*，劉博丹，梁志鵬

(1.塔里木大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300)

科學(xué)研究

Lin28B基因表達(dá)與綿羊初情期啟動(dòng)的關(guān)系研究

盧萍平1,2，邢 鳳1,2*，劉博丹1,2，梁志鵬1,2

(1.塔里木大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300)

初情期是家畜從不能繁殖到獲得繁殖能力的標(biāo)志，是雌性動(dòng)物發(fā)育過程中的一個(gè)關(guān)鍵階段。研究以性早熟的多浪羊和性晚熟的和田羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)其Lin28B基因外顯子3進(jìn)行克隆，采用Real-time PCR技術(shù)分析Lin28B基因在多浪羊和和田羊幼年期、初情期下丘腦、卵巢中表達(dá)變化，結(jié)果顯示多浪羊和和田羊Lin28B基因外顯子3序列相同，多浪羊下丘腦和卵巢中Lin28B基因mRNA表達(dá)量在初情期時(shí)低于幼年期(P<0.05)；和田羊卵巢Lin28B基因mRNA表達(dá)量在初情期時(shí)低于幼年期(P<0.05)。研究結(jié)果表明,Lin28B基因表達(dá)下調(diào)與初情期啟動(dòng)呈正相關(guān)，該研究對(duì)于揭示Lin28B基因在綿羊初情期啟動(dòng)中的作用及機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

多浪羊；Lin28B；初情期；熒光定量PCR

Lin28是一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲中，是調(diào)節(jié)線蟲發(fā)育時(shí)間的異時(shí)基因[1]。在哺乳動(dòng)物中，該基因的同源基因有兩種，Lin28A和Lin28B。已在人和小鼠等多種哺乳動(dòng)物中鑒定出Lin28B基因[2]，山羊Lin28B基因現(xiàn)已被克隆出來，cDNA序列全長為5 353 bp，包括744 bp編碼區(qū)和4 410 bp的3′ UTR[3]。近年來利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)、轉(zhuǎn)基因等研究發(fā)現(xiàn)Lin28B基因在人青春期及小鼠、山羊等哺乳動(dòng)物初情期啟動(dòng)中具有重要調(diào)節(jié)作用[3,4-8]。在哺乳動(dòng)物幼年期到初情期的發(fā)育過程中，下丘腦、垂體、卵巢中Lin28B基因表達(dá)顯著下降，從而初情期啟動(dòng)。Grieco等[7]研究發(fā)現(xiàn)，與20 d C57BL/6(B6)小鼠相比，25 d、30 d和初情期后C57BL/6(B6)小鼠卵巢中Lin28B基因mRNA表達(dá)顯著下降；Sangiao-Alvarellos等[8]研究發(fā)現(xiàn)Lin28B基因mRNA在新生雌、雄大鼠下丘腦中大量表達(dá)，在幼年期到初情期的過渡中，表達(dá)急劇下降。目前對(duì)Lin28B基因在綿羊初情期啟動(dòng)中表達(dá)及作用研究還未見報(bào)道。多浪羊是新疆的一個(gè)優(yōu)良肉脂兼用型地方綿羊品種，據(jù)《新疆家畜家禽品種志》[9]記載，多浪羊具有生長發(fā)育快、有寶貴的早熟性和多胎性、產(chǎn)肉性能好、遺傳性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，早熟性尤其突出，4～5月齡達(dá)到初情期，6～8月齡可初配；和田羊是新疆特有的短脂尾異質(zhì)半粗毛羊，性晚熟，初情期較晚，大約1.5歲初配；多浪羊和和田羊?yàn)檠芯烤d羊初情期啟動(dòng)機(jī)制提供了寶貴的材料。本研究以性早熟的多浪羊和性晚熟的和田羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)Lin28B基因外顯子3進(jìn)行克隆，采用Real～time PCR技術(shù)分析Lin28B基因在多浪羊和和田羊下丘腦、卵巢中表達(dá)變化，為揭示Lin28B基因在綿羊初情期啟動(dòng)中的作用及機(jī)制，培育性早熟的綿羊品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集 試驗(yàn)分別選用多浪羊和和田羊母羊各12只，其中幼年期(30日齡)各6只，初情期多浪羊(4月齡)、和田羊(10月齡)各6只。采集下丘腦、卵巢組織2 g置于DEPC水處理的1.5 mL EP管中，并立即投入液氮中冷凍備用。

1.1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶，DNA Marker、dNTP、SYBR Premix Ex TaqⅡ定量試劑盒，凝膠回收試劑盒等。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取 Trizol一步法提取下丘腦、卵巢組織中的總RNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，然后利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒的要求進(jìn)行：首先混合總RNA 2 μL(約2 μg)，oligo (dT)18(0.25 μg/μL)2 μL，dNTPs (2.5 mmol/μL) 2 μL和RNase free H2O 7μL，然后65 ℃ 5 min，冰浴2 min，再加入5×First-Strand Buffer 4 μL，DTT(0.1 mol/L) 1 μL，RNase inhibitor(40 U/μL)1μL，SuperscriptTMⅢ 反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)0.6 μL，最后加RNase free H2O水補(bǔ)足總體積到25 μL。按照55 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，RT產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 引物合成和RT-PCR擴(kuò)增、克隆測(cè)序Lin28B基因引物序列參考文獻(xiàn)[10]，引物F1: 5′-G CATATTATTCATGGAAGGAT-3′，R1: 5′-CGT TTGGTTTTCTTTTTTGT-3′，對(duì)多浪羊和和田羊下丘腦和卵巢中Lin28B基因外顯子3進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用DNA回收試劑盒回收，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大場(chǎng)桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取3個(gè)陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time PCR)Lin28B基因?qū)崟r(shí)熒光定量引物同1.2.4中的引物，以持家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，內(nèi)參引物參考文獻(xiàn)[11]，引物序列為：F: 5 ′-AAGTTCCACGGCACAGTCAA-3′，R: 5′-ACCACATACTCAGCACCAGC-3′。反應(yīng)體系包括cDNA 0.5 μL，H2O 3.95 μL，2×Brilliant?Ⅱ SYBR?Green QPCR Master Mix 5 μL，引物0.1 μL，Rox 0.15 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，50.0 ℃30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃讀板(plate read)，35個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，用2-△△Ct的方法[12]計(jì)算基因的表達(dá)水平，確定基因的表達(dá)豐度。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

用 SAS 9.2軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取

對(duì)采集的下丘腦、卵巢組織提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)對(duì)所取得的總RNA樣品稀釋后測(cè)其OD260及OD280值，OD260/OD280在1.8～1.9之間，適合進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。總RNA的凝膠電泳結(jié)果顯示清晰的28S與18S條帶，同時(shí)還可以看到5S條帶。

2.2 Lin28B基因外顯子3擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)多浪羊下丘腦、卵巢中Lin28B基因表達(dá)情況進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，Lin28B基因在綿羊下丘腦和卵巢中均有表達(dá)，片段大小為177 bp，引物的特異性較好。

圖1初情期多浪羊下丘腦、卵巢RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
M.ML2000；1.卵巢；2.下丘腦
Fig.1 RT-PCR ofLin28Bgene in hypothalamus and ovary of Duolang sheep on puberty
M.ML2000；1.ovary;2.hypothalamus

2.3 多浪羊與和田羊 Lin28B基因外顯子3序列比對(duì)結(jié)果

對(duì)多浪羊與和田羊Lin28B基因外顯子3進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，利用DNAman對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)結(jié)果見圖2。由圖2可知，多浪羊和和田羊序列的同源性為100%，多浪羊與NCBI Genbank中綿羊Lin28B基因外顯子3序列(JQ277701.1)的同源性為98.31%，與牛Lin28B基因外顯子3序列(XM_002707838.3)的同源性為98.87%。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)多浪羊與和田羊幼年期及初情期下丘腦、卵巢中Lin28B基因 mRNA表達(dá)情況進(jìn)行了分析結(jié)果見表1。由表1可知，多浪羊下丘腦和卵巢中Lin28B基因mRNA表達(dá)量在初情期低于幼年期(P<0.05)；和田羊卵巢Lin28B基因mRNA表達(dá)量在初情期低于幼年期(P<0.05)，和田羊下丘腦中Lin28B基因mRNA表達(dá)量初情期低于幼年期，但差異不顯著(P>0.05)；由此可知，在幼年期至初情期的過渡過程中，多浪羊下丘腦和卵巢中Lin28B基因mRNA表達(dá)均下降，和田羊卵巢中Lin28B基因mRNA表達(dá)下降。

圖2 綿羊、牛Lin28B基因外顯子3序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Alignment of the nucleotide sequences of Lin28B gene of Duolang sheep and Hetian sheep with those of sheep(JQ277701.1)and cattle(XM_002707838.3)

表1 Lin28B基因在多浪羊、和田羊下丘腦、卵巢中的表達(dá)量Table 1 Expression quantity of Lin28B gene in hypothalamus and ovary

注：同列不同字母表示差異顯著。

Notes:Offerent supersiripts in the same row indicate significant difference.

3 討 論

3.1 Lin28B基因序列比對(duì)結(jié)果

本研究對(duì)測(cè)序得到的多浪羊、和田羊Lin28B基因序列與NCBI Genbank中綿羊、牛的Lin28B基因序列進(jìn)行了同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多浪羊和和田羊序列同源性為100%，多浪羊與綿羊同源性為98.31%，與牛的同源性為98.87%，說明Lin28B基因在進(jìn)化的過程中具有較高的保守性。

3.2 關(guān)于Lin28B基因的表達(dá)分析

人和哺乳動(dòng)物正常的初情期是下丘腦-垂體-性腺軸準(zhǔn)確發(fā)動(dòng)的結(jié)果[13-14]。研究發(fā)現(xiàn),Lin28B基因主要在繁殖相關(guān)的組織如下丘腦、垂體、卵巢、睪丸中表達(dá)量較高，在下丘腦-垂體-性腺軸(HPGA)均有分布，是其參與初情期啟動(dòng)和繁殖調(diào)控的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[8,15]。本研究發(fā)現(xiàn)Lin28B基因在多浪羊和和田羊下丘腦和卵巢中表達(dá)量較高，由此可推測(cè)Lin28B基因在綿羊初情期啟動(dòng)和繁殖活動(dòng)中具有重要調(diào)節(jié)作用。

3.3 Lin28B基因與綿羊初情期啟動(dòng)的關(guān)系

Cao等[3]報(bào)道山羊Lin28B基因內(nèi)2934和3053位點(diǎn)與山羊初情期啟動(dòng)有關(guān)，Lin28B基因是調(diào)控山羊初情期啟動(dòng)的重要基因。對(duì)性早熟的多浪羊和性晚熟的和田羊Lin28B基因外顯子3進(jìn)行了克隆，發(fā)現(xiàn)它們的序列相同，多浪羊Lin28B基因多態(tài)性是否與初情期啟動(dòng)具有相關(guān)性，我們將在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)多浪羊初情期下丘腦Lin28B基因mRNA表達(dá)低于幼年期，而和田羊初情期下丘腦中Lin28B基因表達(dá)量低于幼年期，但沒有達(dá)到顯著水平，這也許是多浪羊初情期比較早的原因之一，將在后續(xù)試驗(yàn)中對(duì)此進(jìn)一步深入研究。前人研究發(fā)現(xiàn)猴、小鼠、大鼠Lin28B基因在下丘腦、卵巢中的表達(dá)呈發(fā)育性變化，且在初情期時(shí)的表達(dá)量明顯下降，初情期啟動(dòng)[7-8,16]。本研究發(fā)現(xiàn)多浪羊在幼年期到初情期的過渡過程中，下丘腦和卵巢中Lin28B基因mRNA表達(dá)下降，因此推測(cè)Lin28B基因在綿羊初情期啟動(dòng)中具有重要作用。

4 結(jié) 論

Lin28B基因表達(dá)下調(diào)與初情期啟動(dòng)呈正相關(guān)，該研究對(duì)于揭示Lin28B基因在綿羊初情期啟動(dòng)中的作用及機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

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Lin28BGeneExpressionanditsRoleintheOnsetofPubertyofSheep

LU Ping-ping1,2,XING Feng1,2*,LIU Bo-dan1,2,LIANG Zhi-peng1,2

(1．CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,Alar,XinJiang843300,China;2．KeylaboratorylofTarimAnimalHusbandryScienceandTechnology,XinJiangProduction&ConstructionCorps,Alar,Xinjiang843300,China)

Puberty of animals marked their fertility and is a key stage in female animal development.Precocious sheep breed,Duolang sheep,and late-maturing sheep breed,Hetian sheep were selected as subjects in the study,the exon 3 of Lin28B gene of the selected animals were cloned,and the real-time PCR technology was used to examine the mRNA expression level of Lin28B gene in the hypothalamus and ovary of juvenile stage and pubertal stage.The results showed the sequences alignment of Lin28B exons 3 of Duolang sheep and Hetian sheep were the same;the expression level of Lin28B gene in the hypothalamus and ovary were significantly lower than that in juvenlie period of Duolang sheep(P<0.05),the expression level of Lin28B gene in the ovary was significantly lower than that in the juvenlie period of Hetian sheep(P<0.05).The results indicated that the down-regulated expression of Lin28B gene was positively correlated with the onset of puberty in sheep.The study can help to provide a scientific basis for revealing the effect and mechanism of Lin28B gene in the onset of puberty in sheep.

Duolang sheep;Lin28B;puberty;qPCR

2014-04-29，

2014-06-03

塔里木大學(xué)校長基金項(xiàng)目(TDZKBS20103)；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2014024)

盧萍平(1991-)，女，甘肅通渭人，本科，研究方向：動(dòng)植物檢疫。E-mail:1530633340@qq.com

*[通訊作者]邢 鳳(1981-)，女，山東曹縣人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。E-mail: xingfeng2001@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)09-0014-04