陳生梅，孫永剛，徐驚濤

(青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

牦牛、黃牛卵巢卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的比較研究

陳生梅，孫永剛，徐驚濤*

(青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

對53頭成年黃牛和44頭成年牦牛卵巢形態(tài)、表面卵泡數(shù)量、黃體狀況以及卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)等進行了比對研究,探討牦牛和黃牛卵巢的形態(tài)學(xué)差異和卵泡卵母細(xì)胞發(fā)育變化規(guī)律。結(jié)果表明，成年黃牛卵巢的體積(11.12±5.77vs.6.92±7.0)和重量(5.85±2.98 vs.3.19±1.58)顯著大于成年牦牛卵巢(P<0.05)；成年黃牛Ⅰ級卵泡數(shù)(13.04±8.12vs.7.97±3.72)、Ⅲ級卵泡數(shù)(0.42±0.52vs.0.02±0.15)、總卵泡數(shù)(14.46±8.92vs.8.98±3.87)和卵巢黃體直徑(1.54±0.44 vs.1.2±0.51)顯著大于牦牛(P<0.05)；采集卵巢卵母細(xì)胞，黃牛卵母細(xì)胞數(shù)量顯著多于牦牛，經(jīng)體外成熟培養(yǎng)A級卵母細(xì)胞培養(yǎng)24 h第一極體的排除率顯著高于B級和C級卵母細(xì)胞，同一體外成熟時間和相同分級的黃牛和牦牛卵母細(xì)胞第一極體的排除率差異不顯著。

牦牛；黃牛；卵巢；卵泡；卵母細(xì)胞

牦牛作為是青藏高原畜牧業(yè)的支柱，對當(dāng)?shù)啬羺^(qū)的經(jīng)濟、文化、社會發(fā)展具有舉足輕重的意義[1]，由于牦牛品種原始、生存環(huán)境和分布區(qū)域獨特，其母牛繁殖利用年限較短，產(chǎn)犢間隔較長，繁殖力較低，多數(shù)母牦牛兩年產(chǎn)一胎或三年兩胎，牦牛選育改良因世代間隔長而導(dǎo)致進展緩慢，如何提高牦牛繁殖力是目前生產(chǎn)中亟待解決的問題[2-3]。卵巢為雌性動物最重要的生殖器官，能夠周期性地排出卵子和產(chǎn)生雌激素及黃體酮的內(nèi)分泌功能。卵巢上卵泡與黃體周期性的交替變化參與調(diào)節(jié)哺乳動物的生殖生理過程[4]。本研究通過對成年牦牛和成年黃牛卵巢進行形態(tài)學(xué)比較，卵泡的分級比較以及可供體外培養(yǎng)有效卵母細(xì)胞數(shù)量的研究，探討牦牛和黃牛卵巢的形態(tài)學(xué)差異及卵泡卵母細(xì)胞發(fā)育變化規(guī)律，為牦牛繁殖生理研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

53頭成年黃牛和44頭成年牦牛卵巢采集于青海高原肉食品加工中心。卵巢樣品采集時間為10～11月。屠宰前試驗牛精神、營養(yǎng)狀況良好，年齡在3-6歲。卵巢采集后左右兩側(cè)做好標(biāo)記后置于含青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的生理鹽水中，2 h內(nèi)運回實驗室。

1.2 卵巢的測定和卵泡分類

剪去卵巢周圍的組織、用生理鹽水洗凈卵巢表面血液后用游標(biāo)卡尺測量其長、寬、厚以及上面黃體基部直徑及重量，卵巢長、寬、厚之積作為體積；參照崔燕等[5]對牦牛卵泡的分類方法對卵泡進行分類：Ⅰ級卵泡(直徑≤5 mm),Ⅱ級卵泡(5 mm < 直徑≤10 mm),Ⅲ級卵泡(直徑> 10 mm)。

1.3 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)

黃牛和牦牛卵巢經(jīng)生理鹽水沖洗后用10 mL注射器帶12號針頭抽吸卵巢表面卵泡。將收集到的卵泡液置體視顯微鏡下檢出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體。卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體按照包裹卵丘細(xì)胞進行分類：A級：卵丘細(xì)胞層完整而致密的卵母細(xì)胞；B：卵丘細(xì)胞層部分脫落的卵母細(xì)胞；C：卵丘細(xì)胞極少或全部脫落的裸卵。卵母細(xì)胞于50 μL培養(yǎng)滴(TCM-199含25 mM Hepes、10%FCS、0.2 mM丙酮酸鈉、0.2 U/mL FSH、1 μg/mL E2、100 U/ml青霉素、100 μg/mL鏈霉素、0.26 mM NaHCO3)置38.6℃ 5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)24 h。

1.4 卵母細(xì)胞成熟的判定

培養(yǎng)后卵母細(xì)胞用含0.1%透明質(zhì)酸酶的m-PBS液消化除去卵丘細(xì)胞，將得到的裸卵在實體顯微鏡下觀察，排出第一極體(Pb1)的卵母細(xì)胞定義為成熟，否則認(rèn)為未成熟。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

檢測結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件進行t檢驗和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛和黃牛卵巢形態(tài)、表面卵泡比較

牦牛和黃牛卵巢的形態(tài)相似，牦牛卵巢較黃牛卵巢小，黃牛卵巢顏色發(fā)白而牦牛卵巢表面顏色較暗，部分卵巢表面有卵泡和黃體而略有變形，呈現(xiàn)圓形或三角形，卵巢門無明顯凹陷(圖1A，1D)。對44頭成年牦牛和53成年黃牛卵巢的形態(tài)學(xué)比較研究，結(jié)果見表1：成年黃牛卵巢的長度、寬度、體積為和重量顯著大于牦牛(P<0.05)；而成年牦牛和黃牛卵巢的厚度差異不顯著(P>0.05)。

對比成年牦牛和黃牛卵巢表面卵泡，由表2可見，黃牛卵巢表面總卵泡數(shù)為顯著大于牦牛(P<0.05)。對于不同級別的卵泡，黃牛卵巢表面Ⅰ級卵泡數(shù)和Ⅲ級卵泡數(shù)同樣顯著多于牦牛(P<0.05)，而兩個品種Ⅱ級卵泡數(shù)差異不顯著(P>0.05)。

表1 牦牛和黃牛卵巢形態(tài)比較Table 1 Morphological comparison of Yak and Cattle ovarian

注：*表示差異顯著(P<0.05)。表2、表4同。

Notes: Values with different superscripts differ significantly (P<0.05).The same as in Table 2 and Trble 4.

表2 牦牛和黃牛卵巢表面卵泡比較Table 2 Follicular comparison of Yak and Cattle ovarian

2.2 牦牛和黃牛卵巢上黃體對卵泡發(fā)育的影響

成年牦牛和黃牛卵巢上黃體對卵泡發(fā)育的影響見表3。由表3知，成年黃牛的黃體直徑為顯著大于牦牛(P<0.05)；同時，在兩個品種上，有黃體卵巢的重量顯著大于無黃體卵巢的重量(P<0.05)，但是Ⅰ級卵泡數(shù)、Ⅱ級卵泡數(shù)和總卵泡數(shù)差異不顯著(P>0.05)；牦牛有黃體卵巢上Ⅲ級卵泡數(shù)為0.06±0.24個，而無黃體卵巢上無Ⅲ級卵泡；黃牛卵巢上有無黃體其Ⅲ級卵泡數(shù)差異不顯著。采集黃牛和牦牛卵巢卵母細(xì)胞，黃牛卵巢平均卵母細(xì)胞和A、B級卵母細(xì)胞數(shù)顯著高于牦牛(P<0.05),見表4。

2.3 牦牛和黃牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)

黃牛卵母細(xì)胞胞質(zhì)顏色淺，周圍顆粒細(xì)胞較為松散，而牦牛卵母細(xì)胞胞質(zhì)顏色較深，顆粒細(xì)胞包裹完整而致密(圖1B、1E)，胞質(zhì)顏色較暗，而黃牛卵母細(xì)胞周圍卵丘細(xì)胞較為松散，胞質(zhì)顏色稍淺；卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后，周圍顆粒細(xì)胞擴散(圖1C、1F)。成熟培養(yǎng)結(jié)果見圖2，黃牛和牦牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)16 h成熟率顯著低于20 h、24和28 h的成熟率(P<0.05)，而兩個品種卵母細(xì)胞培養(yǎng)20 h后的成熟率差異不顯著(P>0.05)；在體外培養(yǎng)相同時間，黃牛和牦牛卵母細(xì)胞的成熟率差異不顯著。對卵母細(xì)胞進行分級后培養(yǎng)24 h，結(jié)果如圖3所示，A卵母細(xì)胞的成熟率顯著高于B級和C級，3個等級卵母細(xì)胞的成熟率之間差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

牦牛為季節(jié)性發(fā)情的動物，其發(fā)情季節(jié)主要集中在氣候溫暖、牧草豐盛的暖季(7～10月)[6]，屠宰時間一般集中于10～11月份，由于受屠宰季節(jié)的限制，其非發(fā)情季節(jié)牦牛卵巢卵泡的發(fā)育還有待進一步研究。牦牛繁殖率較低的原因之一是母畜一生中卵巢中排出的成熟卵母細(xì)胞數(shù)量較少有關(guān)[7]。

表3 牦牛和黃牛卵巢上黃體對卵泡發(fā)育的影響Table 3 Effect of corpus luteum on follicular development in Yak and Cattle

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Notes:Data in same column with lowercase superscripts indicate significant difference(P<0.05);data with same letter indicate insignificany differens(P>0.05).

表4 牦牛和黃牛卵巢卵泡卵母細(xì)胞數(shù)及可用卵母細(xì)胞比較Table 4 Total oocytes and available oocytes in Yak and Cattle ovarian

圖1 牦牛、黃牛卵巢及卵母細(xì)胞形態(tài)A，D分別為黃牛和牦牛卵巢；B，E分別為黃牛和牦牛卵母細(xì)胞；C，F(xiàn)分別為成熟培養(yǎng)24 h后的黃牛和牦牛卵母細(xì)胞Fig.1 Mmorphology of ovarian and oocytes in Yak and Cattle A,D are cattle and yak ovary respectively.B,E are cattle and yak oocytes respectively;C,F are oocytes of cattle and yak after 24 h culturing respectively

圖2 培養(yǎng)時間對黃牛和牦牛COCs IVM的影響Fig.2 Effect of culture time on COCs IVM in cattle and yak

圖3 卵母細(xì)胞分級對黃牛和牦牛COCs IVM的影響Fig.3 Effect of oocyte grade on COCs IVM in cattle and yak

試驗對比成年牦牛和黃牛卵巢表面卵泡，發(fā)現(xiàn)黃牛卵巢表面總卵泡數(shù)顯著多于牦牛。對于不同級別的卵泡，黃牛卵巢表面Ⅰ級卵泡數(shù)和Ⅲ級卵泡數(shù)同樣顯著多于牦牛，而兩個品種Ⅱ級卵泡數(shù)差異不顯著。成年牦牛卵巢形態(tài)和卵泡數(shù)量與張壽[7]等、藺國珍等[8]的研究結(jié)果基本一致。成年牦牛和成年黃牛有黃體卵巢重量顯著大于無黃體卵巢，主要是卵巢上黃體生長顯著增加了卵巢的重量，牦牛有黃體卵巢上有優(yōu)勢卵泡、無黃體的卵巢無優(yōu)勢卵泡；而黃牛卵巢有無黃體均存在優(yōu)勢卵泡；研究表明，懷孕母牛黃體持續(xù)分泌孕酮對下丘腦和垂體前葉產(chǎn)生負(fù)反饋作用，抑制垂體前葉產(chǎn)生FSH ，雌激素的分泌量不足，使卵巢上既使有卵泡發(fā)育也難以成熟排卵[8]，而卵巢黃體與優(yōu)勢卵泡之間的關(guān)系有待進一步研究。卵母細(xì)胞作為一個高度特化的生殖細(xì)胞，卵母細(xì)胞的成熟及質(zhì)量對卵母細(xì)胞的激活、受精及其后繼的胚胎發(fā)育均有重要影響[9]，卵母細(xì)胞的成熟是一個復(fù)雜的、動態(tài)生物學(xué)過程，涉及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、卵丘細(xì)胞和透明帶等的形態(tài)學(xué)變化[10]。研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞發(fā)育形成的胚胎/比體外成熟的卵母細(xì)胞具有更強的發(fā)育能力[11]，主要原因是體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟不同步，在卵胞質(zhì)積累發(fā)育必要的因子達(dá)到完全成熟之前卵母細(xì)胞核已經(jīng)成熟[12]。對黃牛和牦牛的卵母細(xì)胞進行體外培養(yǎng)，隨體外培養(yǎng)時間的延長，卵母細(xì)胞成熟率增加，黃牛和牦牛卵母細(xì)胞之間成熟率差異不顯著，依卵丘細(xì)胞的包裹層數(shù)對卵母細(xì)胞進行分類后體外成熟，A級、B級和C級卵母細(xì)胞成熟率差異顯著，而同等級的黃牛和牦牛卵母細(xì)胞之間差異不顯著，研究表明，卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞體外成熟效果和胚胎的發(fā)育程度有重要的調(diào)節(jié)作用[13]。

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StudyonOvarianandFollicleDevelopmentandinvitroMaturationofOocytesinCattleandYak

CHEN Sheng-mei,SUN Yong-gang,XU Jing-tao*

(QinghaiAcademyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,Xining,Qinghai810016,China)

In order to study ovarian and follicle development in Cattle and Yak,the experiment compared ovarian morphology,number of follicles,luteal situation and oocyte IVM.The results showed that adult cattle ovarian volume(11.12±5.77vs.6.92±7.0),weight(5.85±2.98vs.3.19±1.58),number of Grade Ⅰ follicles(13.04±8.12vs.7.97±3.72),number of Grade Ⅲ follicles(0.42±0.52vs.0.02±0.15),total follicles(14.46±8.92vs.8.98±3.87) and luteal diameter( 1.54±0.44 vs.1.2±0.51) were significantly higher than those of yak (P<0.05).Collection oocyte in ovarian of cattle and yak,the number of cattle oocytes were significantly higher than that of yak.The maturation rate of grade A oocytes cultured for 24h was significantly higher than that of B and C grade oocytes.But there was no significant difference between cattle oocytes and yak oocytes in same culture time and same grade.

yak; cattle; ovarian; follicle; oocytes

2014-05-03，

2014-05-19

科技部國際科技合作項目(2013DFA31420)

陳生梅(1968-)，女，青海湟中人，大專，主要從事動物胚胎工程研究。E-mail:chenshengmei2014@163.com

徐驚濤(1964-)，男，河南西華人，副研究員，本科，主要從事動物胚胎工程研究。E-mail:xujt.8964@aliyun.com

S811.6

A

1005-5228(2014)07-0054-04