任志國(山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院普通外科,山東 臨沂 276004)

·論著·

基質(zhì)金屬蛋白酶3基因多態(tài)性與漢族人結(jié)腸癌的相關(guān)性

任志國
(山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院普通外科,山東 臨沂 276004)

目的探討漢族人基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與結(jié)腸癌的關(guān)系。方法應(yīng)用限制性片段長度多態(tài)性方法檢測116例結(jié)腸癌患者和130例正常對照者的MMP-3基因啟動(dòng)區(qū)-1171 5A/6A 多態(tài)性，分析其基因型與結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及臨床分期的相關(guān)性。結(jié)果結(jié)腸癌患者5A/5A+5A/6A基因型頻率顯著高于對照組(OR=2.104，95%CI=1.247～3.549)，推斷攜帶5A/5A基因型的個(gè)體發(fā)生結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。而且在結(jié)腸癌中，MMP-3-1171 5A/6A 多態(tài)性與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論MMP-3基因啟動(dòng)區(qū)-1171 5A/6A 多態(tài)性可能與漢族人群結(jié)腸癌的遺傳易感性及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。

結(jié)腸腫瘤；基質(zhì)金屬蛋白酶3；多態(tài)現(xiàn)象,遺傳

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.09.005

結(jié)腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈上升趨勢，積極預(yù)防及早期發(fā)現(xiàn)，并積極采取有效的治療措施，成為廣大醫(yī)務(wù)工作者的共同任務(wù)和目標(biāo)。結(jié)腸癌的病因尚未完全闡明，目前認(rèn)為可能與環(huán)境因素及基因變異有關(guān)。有研究[1-2]證實(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrixmetalloproteinase-3，MMP-3)基因多態(tài)性與肺癌、食管癌、乳腺癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但與結(jié)腸癌的關(guān)系，目前國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。MMP-3基因啟動(dòng)子區(qū)存在5A/6A多態(tài)性，影響到基因的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致基因功能改變。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(polymerasechainreactionrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP)方法初步探討MMP-3基因啟動(dòng)區(qū)-1171(5A/6A)的單核苷酸多態(tài)性與我國漢族人結(jié)腸癌發(fā)病的關(guān)系，旨在為其早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)后提供依據(jù)。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2011年1月—2013年9月在山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院經(jīng)病理診斷確診的結(jié)腸癌患者116例，男性69例，女性47例，年齡30～76歲，平均(47.90±11.15)歲。其中包括TNM國際分期Ⅰ期23例，Ⅱ期43例，Ⅲ期32例，Ⅳ期18例。另選擇同期健康體檢者130例作為正常對照，男性74例，女性50例，年齡29～73歲，平均(45.48±8.25)歲，既往無腫瘤病史，無腫瘤家族史和其他遺傳病史。所有研究對象均為漢族，無血緣關(guān)系，且均排除其他呼吸系統(tǒng)疾病、腎炎、風(fēng)濕性疾病及纖維化病變等影響基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的相關(guān)疾病。2組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 儀器及試劑：Taq酶(上海復(fù)華生物技術(shù)有限公司提供)；PCR擴(kuò)增儀(美國PEC公司生產(chǎn))。使用Primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物和測序引物；引物合成及測序由北京六合華大生物科技發(fā)展有限公司完成。

1.3 人血DNA提?。核袑ο蟪槿∏宄靠崭轨o脈血4mL，經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝，于-20℃冰箱保存，常規(guī)酚-氯仿抽提法獲得外周血白細(xì)胞DNA。

1.4MMP-3基因啟動(dòng)區(qū)-1171(5A/6A)的單核苷酸多態(tài)性測定：MMP-3基因型檢測采用PCR-RFLP方法進(jìn)行。

MMP-3基因啟動(dòng)區(qū)-1171 5A/6A上下游擴(kuò)增引物分別為5′-GGTTCTCCATTCATGGGGGGAAAG-A-3′和5′-CTTCCTGGAATTCACATCACTGCCACCA-CT-3′，上游引物靠近3′末端的第二個(gè)核苷酸發(fā)生A→G替代，從而產(chǎn)生一個(gè)TthlllⅠ限制性酶切位點(diǎn)，5A等位基因存在該識別位點(diǎn)。

PCR反應(yīng)組分為模板DNA100ng，10×PCR緩沖液2.5μL，Taq-DNA聚合酶2.5U,MgCl22.0mmol/L，4種dNTP的終濃度各為200μmol/L，上下游引物各200μmol/L，Taq酶1U，總反應(yīng)體積為25μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃ 30s，72℃ 60s，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化，經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。MMP-3基因的PCR產(chǎn)物為129bp，經(jīng)TthlllⅠ65℃消化4h后,5A等位基因的產(chǎn)物為97bp和32bp，而6A等位基因?yàn)?29bp。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0軟件包處理數(shù)據(jù)。采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算各組的基因型頻率和等位基因頻率(檢驗(yàn)是否符合Hardy-Weinberg平衡)，2組基因型頻率的分布采用χ2檢驗(yàn)，并分析各基因型和臨床分期的關(guān)系，估計(jì)研究因素對結(jié)腸癌危險(xiǎn)度采用比值比(oddsratio，OR)和95%可信區(qū)間(confidenceinterval，CI)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組MMP-3基因啟動(dòng)區(qū)-1171 5A/6A多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布：2組MMP-3基因啟動(dòng)區(qū)-1171 5A/6A單核苷酸多態(tài)的基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。結(jié)腸癌組5A等位基因頻率高于對照組(P=0.009)。見表1。

對正常對照人群進(jìn)行遺傳平衡檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MMP-3 基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說明該人群具有群體代表性。

表1 2組MMP-3基因型和等位基因頻率分布比較Table 1 Distribution of the genotypes and allele frequences of MMP-3 in two groups (n，%)

2.2 MMP-3基因啟動(dòng)區(qū)-1171 5A/6A多態(tài)性對結(jié)腸癌發(fā)病危險(xiǎn)度的影響：由于5A/5A基因型頻率在結(jié)腸癌組和對照組中均很低，因此將5A/5A基因型和5A/6A基因合并后進(jìn)行分析。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，結(jié)腸癌組5A/5A+5A/6A基因型頻率顯著高于對照組(P=0.005，OR=2.104，95%CI=1.247～3.549)，推斷攜帶5A/5A基因型的個(gè)體發(fā)生結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。見表2。

表2 MMP-3基因多態(tài)性對結(jié)腸癌發(fā)病危險(xiǎn)度的影響Table 2 Association of MMP-3 polymorphism with the risk of developing colon cancer (n，%)

OR：odds ratio；CI：confidence interval

2.3 MMP-3基因型與結(jié)腸癌臨床分期之間的關(guān)系：在結(jié)腸癌患者中，TNM國際分期Ⅰ期和Ⅱ期無淋巴或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，Ⅲ期和Ⅳ期有淋巴或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，故將Ⅰ、Ⅱ期及Ⅲ、Ⅳ期分別一起討論，分析結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移與MMP-3基因型的關(guān)系。對照組與Ⅰ、Ⅱ期患者比較，基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.490)。Ⅲ、Ⅳ期患者5A/5A+5A/6A基因型頻率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002，OR=3.324，95%CI=1.542～7.164)，提示攜帶5A等位基因與結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。見表3。

表3 MMP-3基因型與結(jié)腸癌臨床分期之間的相關(guān)性Table 3 Association of MMP-3 polymorphism with colon cancer clinical stage (n，%)

*P<0.05vscontrols #P<0.05vsStageⅠand Ⅱ by χ2test

3 討 論

基質(zhì)金屬蛋白酶是一個(gè)大家族，由結(jié)締組織分泌，因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名，其家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)，一般由信號肽區(qū)、前肽區(qū)、催化區(qū)、鉸鏈區(qū)及血紅素結(jié)合蛋白樣區(qū)5個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域組成，各種基質(zhì)金屬蛋白酶間具有一定的底物特異性，但不是絕對的，同一種基質(zhì)金屬蛋白酶可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，而某一種細(xì)胞外基質(zhì)成分又可被多種基質(zhì)金屬蛋白酶降解，但不同酶的降解效率不同[3-4]?；|(zhì)金屬蛋白酶幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分,破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用，從而在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用日益受到重視[5]，被認(rèn)為是該過程中主要的蛋白水解酶，目前基質(zhì)金屬蛋白酶家族已分離鑒別出26個(gè)成員，MMP-3又稱為基質(zhì)分解素1，為基質(zhì)金屬蛋白酶中最重要的一種，MMP-3不僅與腫瘤的生長有關(guān)，而且可以破壞基底膜，促使腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成[6]。MMP-3基因位于11號染色體長臂，其啟動(dòng)子區(qū)的-1171位點(diǎn)因存在5個(gè)腺苷或6個(gè)腺苷不同而存在5A/6A多態(tài)性[7]。研究發(fā)現(xiàn)MMP-3基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性可能以等位基因特異方式調(diào)節(jié)MMP-3基因的轉(zhuǎn)錄[8]。

目前MMP-3與腫瘤的研究較多，賀軍等[9]發(fā)現(xiàn)，MMP-3在肝內(nèi)膽管結(jié)石患者中呈陰性表達(dá)，在肝細(xì)胞癌組織中呈陽性表達(dá)，主要分布在癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中及血管內(nèi)皮細(xì)胞中，提示MMP-3可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生及血管生成密切相關(guān)。朱之坤等[10]認(rèn)為MMP-3在人乳腺癌發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國漢族人MMP-3基因啟動(dòng)區(qū)-1171 5A/6A多態(tài)性與結(jié)腸癌發(fā)病關(guān)系密切。結(jié)腸癌組5A/5A+5A/6A基因型頻率顯著高于對照組，提示攜帶5A等位基因的個(gè)體發(fā)生結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。而且TNM Ⅲ、Ⅳ期患者5A/5A+5A/6A基因型頻率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者，提示攜帶5A等位基因的結(jié)腸癌患者，腫瘤更易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。另外，對照組與Ⅰ、Ⅱ期患者比較，基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并不意味結(jié)腸癌患者發(fā)病與MMP-3基因單核苷酸多態(tài)性無相關(guān)性，可能與所選病例數(shù)尚少等有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

結(jié)腸癌是一種生長較慢的惡性腫瘤，原發(fā)癌腫的倍增時(shí)間平均為620d。早期可無癥狀或因其早期癥狀缺乏特異性而不引起患者和醫(yī)師的注意，發(fā)現(xiàn)時(shí)常為中晚期。總之，我國漢族人群MMP-3基因啟動(dòng)區(qū)-1171 5A/6A多態(tài)性與結(jié)腸癌易感性關(guān)系密切，而且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，為結(jié)腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、判斷預(yù)后等提供了依據(jù)。

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(本文編輯：趙麗潔)

CORRELATIONBETWEENPOLYMORPHISMOFMATRIXMETALLOPROTEINASE-3GENEANDCOLONCANCEROFHANNATIONALITYPATIENTS

RENZhiguo
(DepartmentofGeneralSurgery，theAffiliatedHospitalofShandongMedicalCollege,ShangdongProvince，Linyi276004,China)

ObjectiveToinvestigatewhetherthepolymorphismofmatrixmetalloproteinase-3(MMP-3)promotercontributestothedevelopmentandprogressionofcoloncancerinHannationalitypopulation.MethodsPCR-restrictionfragmentlengthpolymorphismwasappliedtoanalyzetheMMP-3 -1171 5A/6Apolymorphismsincoloncancergroup(116cases)andnormalgroup(130cases).Genotypefrequencieswerecomparedbetweenpatientsandmatchedcontrols,andtheassociationofgenotypeswithclinicalstageswerestudiedincoloncancerpatients.TherelativitybetweenthetumorinvasionandMMP-3-1171 5A/6Apolymorphismincoloncancerpatientswasanalysed.ResultsThefrequencyofthe5A/5A+5A/6AgenotypesintheMMP-3genepolymorphismwassignificantlyhigherincoloncancerpatientsthanthatofcontrols(OR=2.104，95%CI=1.247-3.549),andindividualswith5A/5Agenotypehadanincreaseriskofdevelopingcoloncancercomparedtothosewith6A/6Agenotype.TheMMP-3-1171 5A/6Apolymorphismwaspositivelycorrelatedwiththetumorinvasionincoloncancerpatients(P<0.05).ConclusionMMP-3-1171 5A/6ApolymorphismmaybeassociatedwithgeneticsusceptibilitytocoloncancerandtheinvasivecapabilityofcoloncancerinHannationalitypatients.

colonicneoplasms；matrixmetalloproteinase3；polymorphism,genetic

2014-07-22；

2014-08-27

任志國(1962-)，男，山東海陽人，山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院副主任醫(yī)師，從事消化系統(tǒng)腫瘤診治研究。

R735.35

A

1007-3205(2014)09-1006-04