郭 芳于文成林存智宋曉霞季維娜藺 晨

（1.青島大學，山東 青島 266071；2.青島大學附屬醫(yī)院，山東 青島 266003）

·研究報告·

益氣化痰通絡法對大鼠肺纖維化的干預作用及其機制的研究*

郭 芳1于文成2△林存智2宋曉霞2季維娜2藺 晨2

（1.青島大學，山東 青島 266071；2.青島大學附屬醫(yī)院，山東 青島 266003）

目的 研究益氣化痰通絡法對博來霉素誘導的大鼠肺纖維化的干預作用，以及對血清中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達的影響。方法 雄性Wistar大鼠90只，隨機分成對照組15只，模型組75只，模型組經(jīng)博來霉素造模后，隨機分成中藥組、激素組、乙酰半胱氨酸組、羅紅霉素組和生理鹽水組（模型對照組）各15只，正常鼠糧喂養(yǎng)并每日給藥，分別于第15日、30日和45日后處死大鼠，對大鼠肺組織做病理切片HE染色，并用ELISA法檢測血清中TGF-β1、TNF-α的表達。結(jié)果 HE染色示中藥組的肺泡炎癥、肺纖維化程度較模型對照組顯著減輕，中藥組大鼠血清中TGF-β1、TNF-α的表達顯著低于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（均P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 益氣化痰通絡法對博來霉素誘導的大鼠肺纖維化具有干預作用，其機制可能為減少血清中TGF-β1、TNF-α的表達。

益氣化痰通絡法 肺纖維化 TGF-β1TNF-α

肺纖維化是進展性肺實質(zhì)疾病，其病程高度可變，診斷后的中位生存期僅為3～5年［1］。吸煙，年齡增大、環(huán)境污染等都可成為其發(fā)病原因［2］，其發(fā)病機制尚未明確，仍缺乏有效的治療手段，臨床上主要以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療為主，有效率較低且副作用較大，其臨床價值爭議較大［3］。近年來，中藥對肺纖維化治療作用得到關(guān)注，益氣化痰通絡法組方是由黃芪、白術(shù)、川芎、丹參、半夏組成的復方制劑，針對肺纖維化發(fā)病機制，具有補益肺氣、祛除痰濕、活血通絡的作用。本研究通過動物實驗，觀察益氣化痰通絡法對肺纖維化的干預作用，并研究其可能機制，為尋找新的肺纖維化治療方案奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠，清潔級，體質(zhì)量（200±25）g。購買于青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社，許可證號：scxk魯20130001，清潔級動物房飼養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑 注射用鹽酸博來霉素A5（由日本化藥株式會社生產(chǎn)，批號740141）；中藥（益氣化痰通絡法方藥，采用黃芪15 g，白術(shù)10 g，川芎10 g，丹參20 g，半夏10 g，制成水煎劑150 mL，由北京同仁堂青島藥店有限責任公司制備）；強的松粉末（上海源葉生物科技有限公司提供，批號AF0219LB14）；乙酰半胱氨酸 （上海源葉生物科技有限公司提供，批號WO1024YA413）、羅紅霉素（上海源葉生物科技有限公司提供，批號WO1011SA13）；大鼠TGF-β1和TNF-α的ELISA試劑盒（美國RD System公司提供）。

1.3 實驗儀器 離心機（Eppendorf公司，型號Centrifuge 5415D）；酶標儀（美國biotek生產(chǎn)，型號biotek808）；顯微鏡（OLYMPUS，型號CX31）；-20℃冰箱（由海爾集團提供，型號BCD-215KCFM）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，型號XP1203S）；

1.4 模型制備 采用一次性氣管內(nèi)注入博來霉素法復制大鼠肺纖維化模型，具體方法：10%水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，將其仰臥固定于鼠板上，消毒后沿頸部正中線切開頸部皮膚，鈍性分離頸部肌肉暴露出氣管，在兩個氣管軟骨之間朝向心端注入博萊霉素A5（5 mg/kg，溶于0.2 mL的0.9%氯化鈉注射液中），迅速豎起大鼠并旋轉(zhuǎn)使藥物均勻分布到肺組織中，后消毒縫合頸部切口。對照組采用相同方法注入等量0.9%氯化鈉注射液，以上操作均遵循無菌原則。

1.5 分組及給藥 90只大鼠采用隨機分為對照組15只和模型組75只，模型組經(jīng)博來霉素造模后，隨機分為中藥組、激素組、乙酰半胱氨酸組、羅紅霉素組和模型對照組各15只；對照組正常鼠糧喂養(yǎng)；自造模后第2日開始，中藥組給予益氣化痰通絡法的中藥水煎劑5 mL/次，每日1次；激素組給予強的松5 mg/kg，每日1次；乙酰半胱氨酸組給予乙酰半胱氨酸4 mg/kg，每日3次；羅紅霉素組給予羅紅霉素5 mg/kg，每日1次；模型對照組給予0.9%氯化鈉注射液，2 mL，每日2次；均采用灌胃方法給藥，其中強的松、乙酰半胱氨酸、羅紅霉素制成相應濃度的水溶液或混懸液。

1.6 樣本采集及檢測 于第1、15、30及45日分3批處死大鼠，每批為各組大鼠數(shù)量的1/3，采用腹腔注射過量10%水合氯醛法處死大鼠，腹主動脈取血、離心，保存血清于-20℃冰箱中以備ELISA法測定血清因子；打開胸腔取大鼠左肺組織，用4%甲醛溶液固定，以備HE染色。（1）組織病理學觀察。將肺組織進行脫水、固定、包埋、切片、HE染色制成病理切片。在顯微鏡下觀察肺纖維化的程度，分級標準按Szapiel等［4］方法，即0級：無肺纖維化（-）。1級：輕度肺纖維化（＋）受累面積少于全肺20%。2級：中度肺纖維化（＋＋），占全肺面積的20%～50%。3級：重度肺纖維化（＋＋＋），受累面積＞50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。將等級資料為用計量資料表示，（-）以0表示，（＋）以1表示，（＋＋）以2表示，（＋＋＋）以3表示。（2）血清ELISA法測定。取出保存于-20℃冰箱中的血清，嚴格按照試劑盒步驟測定大鼠血清中的TGF-β1和TNF-α。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS Statisics V17.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)結(jié)果均以（s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理學結(jié)果 各組大鼠不同階段的肺纖維化程度結(jié)果見表1，肺組織結(jié)構(gòu)如圖1所示。對照組：均為正常肺泡結(jié)構(gòu)，未出現(xiàn)異常的病理變化。模型對照組：15 d時肺泡腔及肺泡間隔炎癥細胞浸潤明顯，肺泡間隔增寬，30 d及45 d時肺泡壁增厚、肺泡結(jié)構(gòu)破壞，可見大量成纖維細胞聚集，纖維化程度較重。各治療組的肺纖維化程度較相應時間段模型對照組均顯著減輕（P＜0.05或P＜0.01），中藥組用藥15 d、30 d、45 d后，肺泡炎癥及肺纖維化程度均較相應時間段的模型對照組顯著減輕（P＜0.01）；中藥組與激素組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；30 d、45 d時中藥組較乙酰半胱氨酸組肺纖維化程度的顯著減輕（P＜0.05），15 d時差異無統(tǒng)計學意義；中藥組3個時間段的肺纖維化程度較羅紅霉素組顯著減輕（P＜0.05）。

表1 各組大鼠肺纖維化程度（s）

表1 各組大鼠肺纖維化程度（s）

模型組30 d時n＝4，其余各組n＝5。與對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中藥組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。下同。

45 d對照組模型對照組 2.80±0.45*中藥組 1.23±0.84△△組別15 d 30 d 2.60±0.55*2.75±0.50*0.80±0.45△△1.02±0.71△△激素組0.80±0.45△△1.02±0.02△△乙酰半胱氨酸組 1.41±0.55△△1.80±0.45△#2.03±0.10△#羅紅霉素組 1.60±0.55△△#1.80±0.84△#2.02±0.71△#1.21±0.45△△

圖1 各組大鼠不同時間段肺組織結(jié)構(gòu)（HE染色，100倍）

2.2 各組大鼠血清TGF-β1的含量 見表2。與對照組相比，模型對照組大鼠血清的TGF-β1在3個時間段均明顯升高（P＜0.01）；與模型對照組相比，中藥組、激素組、乙酰半胱氨酸組、羅紅霉素組大鼠血清的TGF-β1在3個時間段均明顯降低（P＜0.01）；中藥組與激素組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；中藥組較乙酰半胱氨酸組大鼠血清TGF-β1明顯降低 （P＜0.01或P＜0.05）；中藥組較羅紅霉素組大鼠血清TGF-β1明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠血清TGF-β1含量比較（ng/L，s）

表2 各組大鼠血清TGF-β1含量比較（ng/L，s）

15 d 30 d 133.43±4.38 134.59±4.78 213.11±8.24*205.11±13.85*143.41±4.51△△136.32±2.83△△激素組45 d對照組 134.91±3.77模型對照組 221.40±10.49*中藥組 135.69±0.73△△組別142.22±4.70△△137.50±2.70△△乙酰半胱氨酸組 175.41±15.03△△##166.36±10.28△△##164.43±24.15△△#羅紅霉素組 173.20±18.45△△##163.51±10.28△△#159.56±19.32△△#134.91±2.82△△

2.3 各組大鼠血清TNF-α的含量 見表3。與對照組相比，模型對照組大鼠血清的TNF-α在3個時間段均明顯升高（P＜0.01）；與模型對照組相比，中藥組、激素組、乙酰半胱氨酸組、羅紅霉素組大鼠血清的TNF-α在3個時間段均明顯降低（P＜0.01）；中藥組與激素組相比各時間段差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；中藥組較乙酰半胱氨酸組大鼠血清TNF-α明顯降低 （P＜0.01或P＜0.05）；中藥組較羅紅霉素組大鼠血清TNF-α明顯降低（P＜0.05）。

3 討 論

肺纖維化主要特征為纖維化改變導致了肺泡結(jié)構(gòu)的破壞，是漸進性進展性肺疾?。?］。肺纖維化患者的生活質(zhì)量差，且干預和治療該病策略的研究進展并不顯著。肺纖維化在中醫(yī)上稱為 “短氣”、“喘證”、“肺痿”、“肺痹”等［6］，其發(fā)病的主要機制是邪盛正虛，且以正氣虧虛為本，正氣不足，無力推動血液正常運行，且久病入絡，形成血瘀氣虛之證候［7］。近年，中藥抗肺纖維化的作用得到廣泛的研究并顯示出良好的應用前景［8］。據(jù)報道，黃芪［9］、白術(shù)可起到補肺氣的作用，肺氣得以補充，血液即可得到正常運行；川芎、丹參有活血化瘀的作用，此類藥物使血運得通；半夏則可化濁祛痰、促使肺絡暢通、肺氣輸布，有利于肺纖維化的治療，但目前尚沒有相關(guān)研究將這幾種中藥組成復方制劑來探討其對肺纖維化的作用，并且其作用的分子機制也研究尚少。本研究用博來霉素復制大鼠肺纖維化模型，采用益氣化痰通絡法進行干預，并與激素、羅紅霉素、乙酰半胱氨酸的療效進行對比，顯示出益氣化痰通絡法具有干預肺纖維化的作用。

表3 各組大鼠血清TNF-α含量比較（ng/L，s）

表3 各組大鼠血清TNF-α含量比較（ng/L，s）

15 d 30 d 148.61±5.61 149.84±5.19 280.06±15.85*277.21±18.90*169.76±4.00△△165.27±4.00△△激素組45 d對照組 151.18±3.74模型對照組 289.67±12.06*中藥組 158.32±2.00△△組別159.32±10.19△△156.99±12.83△△乙酰半胱氨酸組 200.80±5.81△△##191.60±6.01△△#179.12±14.29△△#羅紅霉素組 183.44±11.50△△#184.58±14.58△△#179.40±9.26△△#155.29±12.28△△

TGF-β1在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著顯著作用，可由肺組織中肺泡巨噬細胞、肺泡上皮細胞、成纖維細胞、成肌纖維細胞等產(chǎn)生，它產(chǎn)生過多或其促纖維化作用增強，都可導致纖維化啟動過程中的異常傷口愈合反應。肺纖維化發(fā)病過程中的細胞活化、遷移、侵入、增生性改變都與TGF-β1誘導的穩(wěn)態(tài)微環(huán)境紊亂相關(guān)［10］。TGF-β1可誘導血小板衍生生長因子（PDGF）增殖而募集巨噬細胞、成纖維細胞，可誘導前膠原mRNA產(chǎn)生，誘導膠原酶抑制物-基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）合成而使膠原產(chǎn)生增加、降解減少，可加重上皮細胞損傷、誘導上皮細胞凋亡［11］，促進上皮-間質(zhì)間轉(zhuǎn)化（EMT）［12］，TGF-β1還可刺激其他促炎性和促纖維化細胞因子，如TNF-α、PDGF、IL-1β、IL-13等的分泌，也可促進自身分泌，從而增強和延續(xù)纖維化反應。TNF-α是上調(diào)肺纖維化的一種關(guān)鍵的促炎細胞因子［13］，可由肺泡巨噬細胞表達。TNF-α的主要病理作用為通過聚集炎癥細胞、激活中性粒細胞促進肺泡炎癥，通過刺激細胞凋亡再生、肺成纖維細胞的增殖而促進纖維化形成［13］。研究報道，大鼠和小鼠體內(nèi)的TNF-α表達過度均可誘導肺纖維化發(fā)生，而敲除TNF-α受體的小鼠可免受石棉引起的肺纖維化，更有動物實驗表明，在博來霉素誘導的小鼠體內(nèi)，TNF-α可隨TGF-β1的表達而表達增多，并且可與核因子-κB信號通絡（NF-κB）相互促進，TNF-α在肺纖維化的發(fā)病過程中起到中心作用［14］。TGF-β1和TNF-α均為肺纖維化過程中的重要細胞因子，本實驗通過測定其在血清中的表達以反應大鼠肺纖維化進展情況及藥物的干預作用。

本實驗采用一次性氣管內(nèi)注入博來霉素法復制大鼠肺纖維化模型［15］。模型對照組大鼠體型消瘦、體質(zhì)量下降，唇舌及四肢末端紫紺，并有咳嗽及氣促等癥狀，肺組織病理學檢查中第15日出現(xiàn)了明顯的肺泡炎癥，第 30日、45日可見明顯的肺間質(zhì)纖維化；TGF-β1、TNF-α的測定值均較相應時間段的對照組的數(shù)值明顯升高，說明本實驗造模成功。各治療組大鼠的肺組織病理學觀察結(jié)果示肺纖維化程度均好于模型對照組，測得的TGF-β1、TNF-α值均顯著低于模型組，說明中藥、激素、乙酰半胱氨酸、羅紅霉素均對肺纖維化有不同程度的干預作用。其中，中藥組大鼠與相應時間段的模型對照組比較，大鼠肺組織HE染色示肺泡炎癥及纖維化程度顯著減輕，測得的TGF-β1、TNF-α數(shù)值均較相應時間段的模型對照組數(shù)值明顯降低，說明所用中藥對大鼠肺纖維化具有干預作用，可延緩肺纖維化的進展，且其作用機制可能為下調(diào)大鼠血清中TGF-β1、TNF-α的表達。中藥組與激素組比較，大鼠肺組織肺纖維化的程度以及TGF-β1、TNF-α值差異無統(tǒng)計學意義。中藥組與乙酰半胱氨酸組和羅紅霉素組相比，中藥組大鼠的肺纖維化程度及TGF-β1、TNF-α值在相應時間段顯著降低，說明本實驗所用的中藥復方制劑對肺纖維化的干預作用較羅紅霉素及乙酰半胱氨酸強。

本實驗所用的益氣化痰通絡法組方由益氣藥黃芪、白術(shù)，化瘀通絡藥川芎、丹參和化痰藥半夏組成，實驗結(jié)果表明該中藥方劑對博來霉素誘導的大鼠肺纖維化具有干預作用，且其作用機制可能為降低血清中TGF-β1、TNF-α的表達，以期為肺纖維化的治療開辟新的思路。但其具體作用機理以及最佳用藥療程、用藥劑量尚有待于進一步研究。

［1］ Harari S，Caminati A.IPF：new insight on pathogenesis and treatment［J］.Allergy，2010，6（5）：537-553.

［2］ Varsha T，David C.Exposures and Idiopathic Lung Disease［J］.Semin Respir Crit Care Med，2008，6（29）：670-679.

［3］ Andrew LC，Rokhsara R，Samuel L.Therapeutic update in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Clinic Rev Allerg Immunol， 2011，1（11）：532-536.

［4］ Szapiel SV，Elson NA，F(xiàn)ulmur JD，et al.Bleomycin-induced intestitial pulmona ry disease in the nude athymicmouse［J］. Rev Respir Disease，1979，120（4）：893-897.

［5］ JIN Hua-liang，DONG Jing-cheng.Pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis：from initial apoptosis of epithelial cells to lung remodeling［J］.Chinese medical Joural，2011，124（24）：4330-4338.

［6］ 劉拴紅，李志軍，李藝.肺間質(zhì)纖維化的中醫(yī)藥研究進展［J］.中國中醫(yī)急癥，2010，19（8）：1384-1385.

［7］ 崔永華.肺間質(zhì)纖維化中醫(yī)證治探討［J］.中國中醫(yī)急癥，2006，15（8）：878-895.

［8］ 吳銀根，王豫，喻曉.痰熱清注射液治療呼吸系統(tǒng)疾病臨床研究進展［J］.中國中醫(yī)急癥，2012，21（10）：1643-1644.

［9］ 賴真，姚燦坤，程少冰，等.黃芪對腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡的影響及機制研究［J］.中國中醫(yī)急癥，2008，17（11）：1565-1566.

［10］Isis E.Fernandez1 and Oliver Eickelberg，The Im pact of TGF-β on Lung Fibrosis［J］.Proceedings of the American Thoracic Society，2012，3（19）：111-115.

［11］ Siegel PM.Massague，Cytostatic and apoptotic actions of TGF-beta in homeostasis and cancer［J］.Nat Rev Cancer， 2003，34（3）：807-821.

［12］Li M，Krishnaveni MS，Li C，et al.Epithelium-specific deletion of TGF-b receptor typeⅡprotects mice from bleomycininduced pulmonary fibrosis［J］.Clin Invest，2011，121（121）：277-287.

［13］Agostini C，Gurrieri C.Chemokine/cytockine cocktail in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Proc Am Thorac Soc，2006，3（4）：357-363.

［14］田莉，王獻華，馬小兵，等.TNF-α介導的NF-κB信號通路在肺纖維化中的作用［J］.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2011，38（2）：361-363.

［15］Robert MK，Christppher MH，Richard P，et al.Determinants of initiation and progression of idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Respirology，2009，7（14）：917-933.

Effect of Yiqihuatantongluo Decoction on Rats with Pulmonary Fibrosis

GUO Fang1，YU Wencheng2，LIN Cunzhi2，et al. 1 Qingdao University，Shangdong，Qingdao 266071，China；2 The Affiliated Hospital of Qingdao University，Shandong，Qingdao 266003，China

Objective：To study the intervention effect of Yiqihuatantongluo Decoction on rats with pulmonary fibrosis induced by bleomycin and impact of it on serum TGF-β1and TNF-αlevel.Methods：90 male Wistar rats were randomly divided into control group（15 cases）and model group（75 cases）induced by bleomycin.Then，the model group were again randomly divided into traditional Chinese medicine group，hormone group，acetylcysteine group，roxithromycin group and normal saline group（model control group），with 15 cases in each group.Normal food and corresponding drugs were given daily.The rats were partially killed after 15th d and 30th d，and all killed after 45 d.Lung tissue was made pathological section and HE staining.ELISA method was used to detect the expressions of TGF-β1and TNF-α in serum.Results：HE staining showed that alveolar inflammation and the degree of pulmonary fibrosis of rats in the traditional Chinese medicine group reduced significantly，and the expressions of TGF-β1，TNF-αin the serum of Chinese traditional medicine group are significantly lower than those of model group.Conclusion：Yiqihuatantongluo Decoction has intervention effect on rats with pulmonary fibrosis induced by bleomycin，and its mechanism may be related to reducing the expressions of TGF-β1and TNF-αin serum.

Yiqihuatantongluo method；Pulmonary fibrosis；TGF-β1；TNF-α

R285.5

A

1004-745X（2014）11-1984-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.11.008

2014-07-06）

山東省中醫(yī)藥科技計劃課題（2013-231）

△通信作者