李旭　李雪　胡秀彩等

摘要：從鯽魚(yú)腸道中分離純化獲得1株革蘭氏陽(yáng)性菌，編號(hào)為CB-1，通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、理化特性等研究，初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該菌株能利用葡萄糖產(chǎn)酸，β-半乳糖苷、明膠液化試驗(yàn)為陽(yáng)性，葡萄糖酸鹽、硫化氫、吲哚試驗(yàn)等為陰性；藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，CB-1菌株對(duì)頭孢噻吩、卡那霉素、阿奇霉素等抗生素敏感，對(duì)潔霉素、甲硝唑、制霉菌素等不敏感。為進(jìn)一步研究枯草芽孢桿菌與魚(yú)類健康養(yǎng)殖關(guān)系提供參考。

關(guān)鍵詞：鯽魚(yú)；腸道細(xì)菌；枯草芽孢桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S917.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0244-02

收稿日期：2013-10-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31272692、30800847），江蘇省高校重點(diǎn)專業(yè)類建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：2012-2015）。

作者簡(jiǎn)介：李旭（1992—），男，江蘇徐州人，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物微生物學(xué)研究。

通信作者：呂愛(ài)軍，副教授，主要從事微生物及免疫學(xué)研究，E-mail：lajand@126.com?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）是一種短桿狀、無(wú)莢膜能運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，能產(chǎn)中生芽孢，廣泛分布于土壤、湖泊、海洋、動(dòng)植物體表及其棲息地[1]。2003年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部公布了能夠用于生產(chǎn)微生態(tài)制劑菌種包括：枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）等[2]。最近，白延琴等從秸稈垛底層土壤中分離得到1株枯草芽孢桿菌[1]。周金敏等從黃顙魚(yú)腸道中篩選出1株益生性芽孢桿菌[3]，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌的抗逆性及在消化道中穩(wěn)定性強(qiáng)于其他益生菌。馬如龍等研究斜帶石斑魚(yú)幼魚(yú)腸道的優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌，對(duì)石斑魚(yú)生長(zhǎng)和健康具有促進(jìn)作用[4]。本研究以鯽魚(yú)腸道細(xì)菌為主要研究對(duì)象，從中分離純化獲得1株芽孢桿菌，并進(jìn)行了染色特性、菌體形態(tài)、生理生化特性及藥敏反應(yīng)等研究，以期為鯽魚(yú)腸道細(xì)菌的鑒定、微生態(tài)制劑開(kāi)發(fā)等提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

鯽魚(yú)購(gòu)自江蘇省徐州市某市場(chǎng)，體重約100 g。普通瓊脂培養(yǎng)基、細(xì)菌生化微量鑒定管及藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1腸道細(xì)菌的分離與鑒定參考呂愛(ài)軍等方法[5]進(jìn)行，將新鮮鯽魚(yú)腸道中的菌液，均勻涂布在普通瓊脂平板，30 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取典型單菌落，采用平板劃線法，純化傳代2～3次，轉(zhuǎn)種于4 ℃冰箱保藏、備用。細(xì)菌生理生化特性試驗(yàn)等按常規(guī)方法進(jìn)行，分別挑取單菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色及孔雀綠芽孢染色，鏡檢觀察分離菌株的染色及形態(tài)特征。

1.2.2藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法，用無(wú)菌操作將紙片置于接種分離菌株的普通瓊脂平板，置于30 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h后，量取抑菌圈的直徑，根據(jù)藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)書(shū)，確定該菌對(duì)不同藥物的敏感程度。

2結(jié)果與分析

2.1菌落及形態(tài)特征

從鯽魚(yú)腸道中分離純化獲得1株細(xì)菌，暫時(shí)編號(hào)為CB-1，接種于普通瓊脂平板30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，形成表面干燥、褶皺、扁平、不透明、乳白色、邊緣不整齊、直徑2～5 mm的中大菌落；CB-1菌株為革蘭氏陽(yáng)性大桿菌，產(chǎn)芽孢，芽孢呈橢圓、中生狀（圖1）。

2.2生理生化特性

細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果，分離菌CB-1菌株葡萄糖酸鹽利用試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)及MR試驗(yàn)為陰性，可利用葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能還原硝酸鹽、水解淀粉、分解尿素，不能產(chǎn)生脫羧酶利用賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸脫羧生成胺和二氧化碳；β-半乳糖苷、明膠液化試驗(yàn)為陽(yáng)性。對(duì)CB-1菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性分析，發(fā)現(xiàn)與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[6]描述基本一致，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。

2.3藥敏試驗(yàn)

采用26種抗生素對(duì)CB-1菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算平均值。結(jié)果表明，CB-1菌株對(duì)頭孢菌素類（頭孢噻吩、頭孢哌酮、先鋒霉素Ⅳ）、氨基糖甙類（丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素、氯霉素、乙基西梭霉素）、大環(huán)內(nèi)酯類（阿奇霉素、紅霉素）等抗生素敏感；對(duì)潔霉素、甲硝唑、制霉菌素等不敏感（表1）。

3討論

國(guó)內(nèi)對(duì)鯽魚(yú)腸道中枯草芽孢桿菌的分離鑒定，尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。近年來(lái)，枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖上作為飼料添加劑已被廣泛應(yīng)用。Munro等發(fā)現(xiàn)魚(yú)類腸道菌群主要來(lái)源于所攝取的活飼料而不是養(yǎng)殖水體[7]。邱燕等通過(guò)添加適量枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)可改善草魚(yú)腸道黏膜形態(tài)，促進(jìn)草魚(yú)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[8]。江永明等在飼料中添加枯草芽孢桿菌，能顯著促進(jìn)奧尼羅非魚(yú)的生長(zhǎng)[9]。趙士豪等利用大腸桿菌為抑菌對(duì)象分離到4株芽孢桿菌，研究高效復(fù)合益生菌來(lái)替代抗生素，減少抗生素對(duì)魚(yú)類養(yǎng)殖的不利影響[10]。唐家毅等從水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中篩選出1株芽孢桿菌能夠有效降解水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮[11]。丁祥力等分離1株枯草芽孢桿菌，可有效改善淡水養(yǎng)殖水體的水質(zhì)[12]。賀剛等從草魚(yú)腸道分離出1株枯草芽胞桿菌并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，該菌株對(duì)諾氟沙星、頭孢哌酮、慶大霉素等抗生素高度敏感[13]。本研究從鯽魚(yú)腸道中分離純化出1株枯草芽孢桿菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，CB-1菌株對(duì)諾氟沙星、頭孢哌酮、慶大霉素等敏感，本研究結(jié)果與已有報(bào)道結(jié)果基本一致[13]。關(guān)于鯽魚(yú)腸道中枯草芽孢桿菌的16S rDNA基因分子鑒定及微生態(tài)制劑研制，還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]白延琴，辛小玲，來(lái)有志，等. 枯草芽孢桿菌的分離篩選[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志，2013，32（2）：24-31.

[2]徐海燕，曹斌，辛國(guó)芹，等. 一株芽孢桿菌的分離鑒定及其益生潛質(zhì)分析[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，33（3）：48-53.

[3]周金敏，吳志新，曾令兵，等. 黃顙魚(yú)腸道病原拮抗性芽孢桿菌的篩選與特性研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2012，36（1）：78-84.

[4]馬如龍，楊紅玲，孫云章，等. 2株漁源芽孢桿菌的生物學(xué)特性研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2010，29（9）：505-509.

[5]呂愛(ài)軍，楊正行，劉歡，等. 斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌的分離與生理生化特性[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（24）：412-415.

[6]東秀珠，蔡妙英. 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[7]Munro P D，Barbour A，Birkbeck T H. Comparison of the gut bacterial flora of start feeding larval turbot rearedunder different conditions[J]. Journal of Applied Bacteriology，1994，77（5）：560-566.

[8]邱燕，蔡春芳，戴小芳，等. 枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能與腸道黏膜形態(tài)的影響[J]. 中國(guó)飼料，2010（19）：34-36.

[9]江永明，付天璽，張麗，等. 微生物制劑對(duì)奧尼羅非魚(yú)生長(zhǎng)及消化酶活性的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2011，35（6）：998-1004.

[10]趙士豪，楊會(huì)琴，趙春海. 益生菌芽孢桿菌的分離與初步鑒定[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（18）：271-275.

[11]唐家毅，劉婕，于鐵妹，等. 一株水產(chǎn)芽孢桿菌的鑒定及其培養(yǎng)基優(yōu)化的研究[J]. 淡水漁業(yè)，2008，38（6）：26-30.

[12]丁祥力，王震，陳薇，等. 枯草芽孢桿菌WH-5的分離鑒定及凈水研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（1）：15-19.

[13]賀剛，何力，王朝元，等. 草魚(yú)腸道枯草芽孢桿菌的耐藥性分析[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（22）：219-222.endprint

摘要：從鯽魚(yú)腸道中分離純化獲得1株革蘭氏陽(yáng)性菌，編號(hào)為CB-1，通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、理化特性等研究，初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該菌株能利用葡萄糖產(chǎn)酸，β-半乳糖苷、明膠液化試驗(yàn)為陽(yáng)性，葡萄糖酸鹽、硫化氫、吲哚試驗(yàn)等為陰性；藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，CB-1菌株對(duì)頭孢噻吩、卡那霉素、阿奇霉素等抗生素敏感，對(duì)潔霉素、甲硝唑、制霉菌素等不敏感。為進(jìn)一步研究枯草芽孢桿菌與魚(yú)類健康養(yǎng)殖關(guān)系提供參考。

關(guān)鍵詞：鯽魚(yú)；腸道細(xì)菌；枯草芽孢桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S917.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0244-02

收稿日期：2013-10-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31272692、30800847），江蘇省高校重點(diǎn)專業(yè)類建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：2012-2015）。

作者簡(jiǎn)介：李旭（1992—），男，江蘇徐州人，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物微生物學(xué)研究。

通信作者：呂愛(ài)軍，副教授，主要從事微生物及免疫學(xué)研究，E-mail：lajand@126.com。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種短桿狀、無(wú)莢膜能運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，能產(chǎn)中生芽孢，廣泛分布于土壤、湖泊、海洋、動(dòng)植物體表及其棲息地[1]。2003年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部公布了能夠用于生產(chǎn)微生態(tài)制劑菌種包括：枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）等[2]。最近，白延琴等從秸稈垛底層土壤中分離得到1株枯草芽孢桿菌[1]。周金敏等從黃顙魚(yú)腸道中篩選出1株益生性芽孢桿菌[3]，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌的抗逆性及在消化道中穩(wěn)定性強(qiáng)于其他益生菌。馬如龍等研究斜帶石斑魚(yú)幼魚(yú)腸道的優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌，對(duì)石斑魚(yú)生長(zhǎng)和健康具有促進(jìn)作用[4]。本研究以鯽魚(yú)腸道細(xì)菌為主要研究對(duì)象，從中分離純化獲得1株芽孢桿菌，并進(jìn)行了染色特性、菌體形態(tài)、生理生化特性及藥敏反應(yīng)等研究，以期為鯽魚(yú)腸道細(xì)菌的鑒定、微生態(tài)制劑開(kāi)發(fā)等提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

鯽魚(yú)購(gòu)自江蘇省徐州市某市場(chǎng)，體重約100 g。普通瓊脂培養(yǎng)基、細(xì)菌生化微量鑒定管及藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1腸道細(xì)菌的分離與鑒定參考呂愛(ài)軍等方法[5]進(jìn)行，將新鮮鯽魚(yú)腸道中的菌液，均勻涂布在普通瓊脂平板，30 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取典型單菌落，采用平板劃線法，純化傳代2～3次，轉(zhuǎn)種于4 ℃冰箱保藏、備用。細(xì)菌生理生化特性試驗(yàn)等按常規(guī)方法進(jìn)行，分別挑取單菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色及孔雀綠芽孢染色，鏡檢觀察分離菌株的染色及形態(tài)特征。

1.2.2藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法，用無(wú)菌操作將紙片置于接種分離菌株的普通瓊脂平板，置于30 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h后，量取抑菌圈的直徑，根據(jù)藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)書(shū)，確定該菌對(duì)不同藥物的敏感程度。

2結(jié)果與分析

2.1菌落及形態(tài)特征

從鯽魚(yú)腸道中分離純化獲得1株細(xì)菌，暫時(shí)編號(hào)為CB-1，接種于普通瓊脂平板30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，形成表面干燥、褶皺、扁平、不透明、乳白色、邊緣不整齊、直徑2～5 mm的中大菌落；CB-1菌株為革蘭氏陽(yáng)性大桿菌，產(chǎn)芽孢，芽孢呈橢圓、中生狀（圖1）。

2.2生理生化特性

細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果，分離菌CB-1菌株葡萄糖酸鹽利用試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)及MR試驗(yàn)為陰性，可利用葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能還原硝酸鹽、水解淀粉、分解尿素，不能產(chǎn)生脫羧酶利用賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸脫羧生成胺和二氧化碳；β-半乳糖苷、明膠液化試驗(yàn)為陽(yáng)性。對(duì)CB-1菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性分析，發(fā)現(xiàn)與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[6]描述基本一致，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。

2.3藥敏試驗(yàn)

采用26種抗生素對(duì)CB-1菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算平均值。結(jié)果表明，CB-1菌株對(duì)頭孢菌素類（頭孢噻吩、頭孢哌酮、先鋒霉素Ⅳ）、氨基糖甙類（丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素、氯霉素、乙基西梭霉素）、大環(huán)內(nèi)酯類（阿奇霉素、紅霉素）等抗生素敏感；對(duì)潔霉素、甲硝唑、制霉菌素等不敏感（表1）。

3討論

國(guó)內(nèi)對(duì)鯽魚(yú)腸道中枯草芽孢桿菌的分離鑒定，尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。近年來(lái)，枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖上作為飼料添加劑已被廣泛應(yīng)用。Munro等發(fā)現(xiàn)魚(yú)類腸道菌群主要來(lái)源于所攝取的活飼料而不是養(yǎng)殖水體[7]。邱燕等通過(guò)添加適量枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)可改善草魚(yú)腸道黏膜形態(tài)，促進(jìn)草魚(yú)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[8]。江永明等在飼料中添加枯草芽孢桿菌，能顯著促進(jìn)奧尼羅非魚(yú)的生長(zhǎng)[9]。趙士豪等利用大腸桿菌為抑菌對(duì)象分離到4株芽孢桿菌，研究高效復(fù)合益生菌來(lái)替代抗生素，減少抗生素對(duì)魚(yú)類養(yǎng)殖的不利影響[10]。唐家毅等從水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中篩選出1株芽孢桿菌能夠有效降解水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮[11]。丁祥力等分離1株枯草芽孢桿菌，可有效改善淡水養(yǎng)殖水體的水質(zhì)[12]。賀剛等從草魚(yú)腸道分離出1株枯草芽胞桿菌并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，該菌株對(duì)諾氟沙星、頭孢哌酮、慶大霉素等抗生素高度敏感[13]。本研究從鯽魚(yú)腸道中分離純化出1株枯草芽孢桿菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，CB-1菌株對(duì)諾氟沙星、頭孢哌酮、慶大霉素等敏感，本研究結(jié)果與已有報(bào)道結(jié)果基本一致[13]。關(guān)于鯽魚(yú)腸道中枯草芽孢桿菌的16S rDNA基因分子鑒定及微生態(tài)制劑研制，還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]白延琴，辛小玲，來(lái)有志，等. 枯草芽孢桿菌的分離篩選[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志，2013，32（2）：24-31.

[2]徐海燕，曹斌，辛國(guó)芹，等. 一株芽孢桿菌的分離鑒定及其益生潛質(zhì)分析[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，33（3）：48-53.

[3]周金敏，吳志新，曾令兵，等. 黃顙魚(yú)腸道病原拮抗性芽孢桿菌的篩選與特性研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2012，36（1）：78-84.

[4]馬如龍，楊紅玲，孫云章，等. 2株漁源芽孢桿菌的生物學(xué)特性研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2010，29（9）：505-509.

[5]呂愛(ài)軍，楊正行，劉歡，等. 斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌的分離與生理生化特性[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（24）：412-415.

[6]東秀珠，蔡妙英. 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[7]Munro P D，Barbour A，Birkbeck T H. Comparison of the gut bacterial flora of start feeding larval turbot rearedunder different conditions[J]. Journal of Applied Bacteriology，1994，77（5）：560-566.

[8]邱燕，蔡春芳，戴小芳，等. 枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能與腸道黏膜形態(tài)的影響[J]. 中國(guó)飼料，2010（19）：34-36.

[9]江永明，付天璽，張麗，等. 微生物制劑對(duì)奧尼羅非魚(yú)生長(zhǎng)及消化酶活性的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2011，35（6）：998-1004.

[10]趙士豪，楊會(huì)琴，趙春海. 益生菌芽孢桿菌的分離與初步鑒定[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（18）：271-275.

[11]唐家毅，劉婕，于鐵妹，等. 一株水產(chǎn)芽孢桿菌的鑒定及其培養(yǎng)基優(yōu)化的研究[J]. 淡水漁業(yè)，2008，38（6）：26-30.

[12]丁祥力，王震，陳薇，等. 枯草芽孢桿菌WH-5的分離鑒定及凈水研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（1）：15-19.

[13]賀剛，何力，王朝元，等. 草魚(yú)腸道枯草芽孢桿菌的耐藥性分析[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（22）：219-222.endprint

摘要：從鯽魚(yú)腸道中分離純化獲得1株革蘭氏陽(yáng)性菌，編號(hào)為CB-1，通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、理化特性等研究，初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該菌株能利用葡萄糖產(chǎn)酸，β-半乳糖苷、明膠液化試驗(yàn)為陽(yáng)性，葡萄糖酸鹽、硫化氫、吲哚試驗(yàn)等為陰性；藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，CB-1菌株對(duì)頭孢噻吩、卡那霉素、阿奇霉素等抗生素敏感，對(duì)潔霉素、甲硝唑、制霉菌素等不敏感。為進(jìn)一步研究枯草芽孢桿菌與魚(yú)類健康養(yǎng)殖關(guān)系提供參考。

關(guān)鍵詞：鯽魚(yú)；腸道細(xì)菌；枯草芽孢桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S917.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0244-02

收稿日期：2013-10-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31272692、30800847），江蘇省高校重點(diǎn)專業(yè)類建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：2012-2015）。

作者簡(jiǎn)介：李旭（1992—），男，江蘇徐州人，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物微生物學(xué)研究。

通信作者：呂愛(ài)軍，副教授，主要從事微生物及免疫學(xué)研究，E-mail：lajand@126.com?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）是一種短桿狀、無(wú)莢膜能運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，能產(chǎn)中生芽孢，廣泛分布于土壤、湖泊、海洋、動(dòng)植物體表及其棲息地[1]。2003年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部公布了能夠用于生產(chǎn)微生態(tài)制劑菌種包括：枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）等[2]。最近，白延琴等從秸稈垛底層土壤中分離得到1株枯草芽孢桿菌[1]。周金敏等從黃顙魚(yú)腸道中篩選出1株益生性芽孢桿菌[3]，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌的抗逆性及在消化道中穩(wěn)定性強(qiáng)于其他益生菌。馬如龍等研究斜帶石斑魚(yú)幼魚(yú)腸道的優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌，對(duì)石斑魚(yú)生長(zhǎng)和健康具有促進(jìn)作用[4]。本研究以鯽魚(yú)腸道細(xì)菌為主要研究對(duì)象，從中分離純化獲得1株芽孢桿菌，并進(jìn)行了染色特性、菌體形態(tài)、生理生化特性及藥敏反應(yīng)等研究，以期為鯽魚(yú)腸道細(xì)菌的鑒定、微生態(tài)制劑開(kāi)發(fā)等提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

鯽魚(yú)購(gòu)自江蘇省徐州市某市場(chǎng)，體重約100 g。普通瓊脂培養(yǎng)基、細(xì)菌生化微量鑒定管及藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1腸道細(xì)菌的分離與鑒定參考呂愛(ài)軍等方法[5]進(jìn)行，將新鮮鯽魚(yú)腸道中的菌液，均勻涂布在普通瓊脂平板，30 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取典型單菌落，采用平板劃線法，純化傳代2～3次，轉(zhuǎn)種于4 ℃冰箱保藏、備用。細(xì)菌生理生化特性試驗(yàn)等按常規(guī)方法進(jìn)行，分別挑取單菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色及孔雀綠芽孢染色，鏡檢觀察分離菌株的染色及形態(tài)特征。

1.2.2藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法，用無(wú)菌操作將紙片置于接種分離菌株的普通瓊脂平板，置于30 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h后，量取抑菌圈的直徑，根據(jù)藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)書(shū)，確定該菌對(duì)不同藥物的敏感程度。

2結(jié)果與分析

2.1菌落及形態(tài)特征

從鯽魚(yú)腸道中分離純化獲得1株細(xì)菌，暫時(shí)編號(hào)為CB-1，接種于普通瓊脂平板30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，形成表面干燥、褶皺、扁平、不透明、乳白色、邊緣不整齊、直徑2～5 mm的中大菌落；CB-1菌株為革蘭氏陽(yáng)性大桿菌，產(chǎn)芽孢，芽孢呈橢圓、中生狀（圖1）。

2.2生理生化特性

細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果，分離菌CB-1菌株葡萄糖酸鹽利用試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)及MR試驗(yàn)為陰性，可利用葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能還原硝酸鹽、水解淀粉、分解尿素，不能產(chǎn)生脫羧酶利用賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸脫羧生成胺和二氧化碳；β-半乳糖苷、明膠液化試驗(yàn)為陽(yáng)性。對(duì)CB-1菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性分析，發(fā)現(xiàn)與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[6]描述基本一致，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。

2.3藥敏試驗(yàn)

采用26種抗生素對(duì)CB-1菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算平均值。結(jié)果表明，CB-1菌株對(duì)頭孢菌素類（頭孢噻吩、頭孢哌酮、先鋒霉素Ⅳ）、氨基糖甙類（丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素、氯霉素、乙基西梭霉素）、大環(huán)內(nèi)酯類（阿奇霉素、紅霉素）等抗生素敏感；對(duì)潔霉素、甲硝唑、制霉菌素等不敏感（表1）。

3討論

國(guó)內(nèi)對(duì)鯽魚(yú)腸道中枯草芽孢桿菌的分離鑒定，尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。近年來(lái)，枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖上作為飼料添加劑已被廣泛應(yīng)用。Munro等發(fā)現(xiàn)魚(yú)類腸道菌群主要來(lái)源于所攝取的活飼料而不是養(yǎng)殖水體[7]。邱燕等通過(guò)添加適量枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)可改善草魚(yú)腸道黏膜形態(tài)，促進(jìn)草魚(yú)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[8]。江永明等在飼料中添加枯草芽孢桿菌，能顯著促進(jìn)奧尼羅非魚(yú)的生長(zhǎng)[9]。趙士豪等利用大腸桿菌為抑菌對(duì)象分離到4株芽孢桿菌，研究高效復(fù)合益生菌來(lái)替代抗生素，減少抗生素對(duì)魚(yú)類養(yǎng)殖的不利影響[10]。唐家毅等從水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中篩選出1株芽孢桿菌能夠有效降解水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮[11]。丁祥力等分離1株枯草芽孢桿菌，可有效改善淡水養(yǎng)殖水體的水質(zhì)[12]。賀剛等從草魚(yú)腸道分離出1株枯草芽胞桿菌并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，該菌株對(duì)諾氟沙星、頭孢哌酮、慶大霉素等抗生素高度敏感[13]。本研究從鯽魚(yú)腸道中分離純化出1株枯草芽孢桿菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，CB-1菌株對(duì)諾氟沙星、頭孢哌酮、慶大霉素等敏感，本研究結(jié)果與已有報(bào)道結(jié)果基本一致[13]。關(guān)于鯽魚(yú)腸道中枯草芽孢桿菌的16S rDNA基因分子鑒定及微生態(tài)制劑研制，還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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