劉玉等

摘要建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）同時測定3種三硝基酚類殘留量的方法。樣品經(jīng)改進(jìn)的QuEChERS（快速、簡單、廉價、高效、靈活和安全）前處理方法一步完成提取凈化，經(jīng)添加1%甲酸的乙腈提取，C18和石墨化炭黑（GCB）吸附劑填料凈化，提取液經(jīng)離心后直接過膜上機(jī)檢測，提取和凈化的效果能夠滿足檢測要求。UPLCMS/MS方法采用Accucore PFP 色譜柱（150 mm× 2.1 mm，2.6 μm），柱溫30 ℃，流動相為乙腈和乙酸銨緩沖鹽，梯度洗脫，流速0.3 mL/min，電噴霧電離源負(fù)離子模式（ESI

Symbolm@@ ）、多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測，外標(biāo)法定量。2，4，6三硝基苯酚、2，4，6三硝基間苯二酚和2，4，6三硝基均苯三酚3種三硝基酚類物質(zhì)在0.005～5.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9942～0.9962。在0.01，0.1和1.0 mg/kg水平下的平均加標(biāo)回收率為79.3%～94.8%； 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～6.6%； 方法的檢出限（S/N=3）為0.002～0.005 mg/kg。本方法簡單、快速、靈敏、準(zhǔn)確，滿足環(huán)境污染檢測的要求。

關(guān)鍵詞超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法； 2，4，6三硝基苯酚； 2，4，6三硝基間苯二酚； 2，4，6三硝基均苯三酚； QuEChERS方法； 土壤

1引言

隨著工業(yè)發(fā)展，三硝基酚類物質(zhì)由于其特殊的結(jié)構(gòu)，被廣泛用于含能材料、醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料以及橡膠工業(yè)生產(chǎn)中＼[1，2＼]。三硝基酚類主要有2，4，6三硝基苯酚（俗稱苦味酸，TNP）、2，4，6三硝基間苯二酚（俗稱斯蒂芬酸，TNR）、2，4，6三硝基均苯三酚（TNPG）。由于三硝基酚類物質(zhì)生產(chǎn)和使用過程會流失到土壤和周圍環(huán)境中，能持久存在于土壤環(huán)境中，破壞土壤結(jié)構(gòu)，阻礙或抑制土壤微生物和植物的生命活動；同時由于其具有較強(qiáng)的水溶性，可以通過滲透和降水的淋洗作用污染地表水體系，導(dǎo)致病變，危害人類健康。因此，三硝基酚類對環(huán)境和人類健康造成的危害將備受關(guān)注。

目前對于三硝基酚類物質(zhì)的環(huán)境控制研究多集中在降解菌種的培養(yǎng)、降解反應(yīng)器的研制等污染降解處理方面＼[3～7＼]，在水質(zhì)、土壤的污染監(jiān)控檢測方面卻相對滯后，且多采用分光光度法對三硝基酚類總量進(jìn)行檢測＼[8＼]。目前，檢測硝基酚類的方法主要有分光光度法＼[9＼]、氣相色譜法＼[10＼]、液相色譜法＼[11，12＼]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法＼[13＼]，這些相關(guān)的方法都只涉及部分硝基酚類，對于三硝基酚類特殊的強(qiáng)極性、熱不穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)所適合的檢測方法研究較少。

目前，較常用的前處理方法有固相提?。⊿PE）＼[14～17＼]、加速溶劑提?。ˋSE）＼[18～20＼]、微波輔助提?。∕AE）＼[21～23＼]和超聲波輔助提?。║SE）＼[24～26＼]等，這些方法取代了傳統(tǒng)的耗費(fèi)大量時間和溶劑的普通液液提取，但是通常需要后續(xù)的較繁瑣的操作步驟，甚至要求特殊的設(shè)備或者特殊的高溫等環(huán)境下進(jìn)行，而最初應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測的QuEChERS（Quick， Eesy， Cheap， Effective， Rugged and Safe）方法＼[27，28＼]是一種快速、簡單、高效的樣品前處理方法，在食品和生物安全領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，但在凈化土壤、檢測硝基酚類應(yīng)用少見報道。本研究將超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLCMS/MS）應(yīng)用于三硝基酚類多殘留痕量快速分析，克服了目標(biāo)化合物強(qiáng)極性、易分解、難以檢測分離所帶來的弊端，具有靈敏度高、確證性強(qiáng)、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)勢，將改進(jìn)的QuEChERS方法應(yīng)用于土壤樣品前處理，考察了不同吸附劑的凈化效果，同時簡化了前處理步驟，提取液直接進(jìn)行UPLCMS/MS分析，可實現(xiàn)土壤中3種三硝基酚類物質(zhì)的同時定性與定量檢測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

AcquityTM超高效液相色譜儀（UPLC）， Quattro PremierTMXE三重四級桿質(zhì)譜儀（Waters 公司）； AllegraTM X22R型離心機(jī)（Beckman公司）； Sk8200LH超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)公司）； MilliQA10超純水機(jī)； IKAMS3漩渦混合器； 0.22 μm有機(jī)過濾膜（Waters公司）

3種三硝基酚類標(biāo)準(zhǔn)品分別為2，4，6三硝基苯酚（TNP）、2，4，6三硝基間苯二酚（TNR）和2，4，6三硝基均苯三酚（TNPG）， 均購自德國Dr. Ehrenstorfer GH公司（純度>98%）； 吸附劑填料N丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳黑（GCB）、C18（Agela公司）； 乙腈（色譜純，德國Merck公司）； MgSO4、乙酸銨（分析純）； 實驗用水為超純水。

2.2標(biāo)準(zhǔn)品制備

用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為100 mg/L的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再將單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，實驗時以初始流動相將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3QuEChERS一步提取凈化前處理方法

準(zhǔn)確稱取1.00g土壤樣品，置于15 mL塑料離心管中，加入0.5 mL水浸潤20 min，加入5 mL 1%甲酸的乙腈，渦旋提取2 min，離心后，取上清液， 加入1.0 g無水MgSO4、1.0 g NaCl，渦旋20 s后，離心取上清液，加入吸附劑，渦旋2 min，以10000 r/min高速離心3 min，取上清液， 過0.22 μm濾膜， 上機(jī)檢測。

3結(jié)果與討論

3.1色譜條件的選擇

本實驗選擇乙腈乙酸銨為流動相，采用梯度洗脫，通過實驗證實，一方面乙腈比甲醇洗脫能力強(qiáng)，各組分的分析時間明顯縮短，各色譜峰相對對稱；另一方面，選擇乙酸銨緩沖體系對于三硝基酚類不但分離效果最好，而且沖洗色譜柱比較便利，同時乙酸銨體系在液相色譜質(zhì)譜中也很有優(yōu)勢。選擇優(yōu)化的最佳色譜條件，在5 min內(nèi)完成了3種三硝基酚的分離檢測，分離度好，峰形對稱尖銳，無明顯拖尾，具體土壤基質(zhì)的總離子流圖見圖1。

Symbolm@@ 模式下，對3種三硝基酚物質(zhì)的質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化， 分別采用全掃描和子離子掃描方式優(yōu)化得到了母離子、子離子及各自的最佳錐孔電壓和碰撞能量，以響應(yīng)值最大的碎片離子為定量離子，次級響應(yīng)離子為定性離子。圖2為MRM模式下3種三硝基酚類的定量離子對的單通道掃描質(zhì)譜圖。

3種硝基酚的檢測采用負(fù)離子模式，分別選擇其[M-H]

Symbolm@@ 作為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜裂解分析，在15～40 eV區(qū)間內(nèi)， 不斷增加二級碰撞能量，子離子碎片逐漸增多。

通過質(zhì)譜裂解研究發(fā)現(xiàn)，2，4，6三硝基苯酚準(zhǔn)分子離子峰m/z 228.1 在二級碰撞裂解下，分別失去一個NO2、兩個NO2，生成子離子m/z 182.1和136.1，且m/z 136.1響應(yīng)值較大，選擇為定量離子。2，4，6三硝基間苯二酚準(zhǔn)分子離子峰m/z 244.1，在二級碰撞裂解下，生成子離子m/z 198.1和181.1，分別代表失去NO2，失去NO2和OH，但m/z 181離子峰極不穩(wěn)定，繼續(xù)裂解為小分子離子峰，所以選擇m/z 198.1為定量離子。2，4，6三硝基均苯三酚準(zhǔn)分子離子峰m/z 266.1 在二級碰撞裂解下，失去一個NO2，生成子離子m/z 227.1；苯環(huán)上失去硝基和羥基后，再失去CNO2，發(fā)生重排， 形成，生成m/z 95.1離子，但兩離子峰相比較，m/z 227.1響應(yīng)值、質(zhì)量數(shù)均較大，選擇為定量離子。通過對離子對的選擇和相應(yīng)電壓的確定，得到了最優(yōu)質(zhì)譜條件（表2）。

3.3QuEChERS前處理步驟的簡化

土壤樣品因地區(qū)差異，性質(zhì)差別較大，因此本研究選擇添加1%甲酸的乙腈為提取劑，以增加3種酸性目標(biāo)物在乙腈中的提取率和穩(wěn)定性，并采用無緩沖溶液的QuEChERS方法，進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析。土壤樣品經(jīng)提取、凈化，取上清液過膜待測。方法簡便、操作誤差小，適合日常檢驗。

3.4吸附劑的選擇

吸附劑作用于提取液中，既須盡可能地吸附雜質(zhì)；又要最大限度地保留目標(biāo)物，保證較高的回收率。吸附劑對雜質(zhì)的吸附、凈化很大程度上有利于降低基質(zhì)效應(yīng)，從而減少對ESI電離源質(zhì)譜中響應(yīng)值的干擾。吸附劑的選擇取決于樣品提取物中的脂肪、蛋白、色素等大分子有機(jī)物或者雜質(zhì)等的含量。

土壤樣品中存在脂肪、動植物殘留、色素等雜質(zhì)，為選擇合適的吸附劑，采用2.3節(jié)的操作方法，選擇加入濃度均為25 mg/mL的3種吸附劑C18， GCBC18和PSAC18，分別考察了回收率和凈化效果。 結(jié)果表明， GCBC18吸附劑對幾種目標(biāo)物的回收率最高；且由圖2可知，處理后的土壤基質(zhì)背景值低，分離度和峰形均較好，說明該組合吸附劑同時對脂肪、蛋白和植物片狀結(jié)構(gòu)色素等雜質(zhì)的凈化效果較好，因此選擇GCBC18作為吸附劑。

采用經(jīng)過改進(jìn)的QuEChERS前處理方法處理土壤樣品并檢測，結(jié)果表明，0.1 mg/L的3種硝基酚的基質(zhì)效應(yīng)分別為3.9%，4.1%和3.8%， 1 mg/L的3種硝基酚的基質(zhì)效應(yīng)分別為4.7%，2.0%和3.2%，均小于10%，基質(zhì)效應(yīng)對定量分析的影響較小，可以忽略，這進(jìn)一步說明改進(jìn)的前處理方法凈化效果好，可以避免使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量方法更簡便。

3.8實際樣品測定

為了驗證方法的實用性，選擇采集幾個土壤樣品，包括農(nóng)田、化學(xué)工業(yè)區(qū)、某合成區(qū)域附近3個不同地區(qū)，同時將不同土壤基質(zhì)添加50 μg/kg濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作對照，采用本方法進(jìn)行檢測分析，結(jié)果見表4。被測的農(nóng)田、化學(xué)工業(yè)區(qū)土壤樣品未檢出目標(biāo)化合物，而某合成區(qū)域附近土壤含有一定濃度的2，4，6三硝基間苯二酚。同時，也充分證實本方法符合能夠滿足三硝基酚類快速檢測和確證分析。

4結(jié)論

建立了土壤中2，4，6三硝基苯酚、2，4，6三硝基間苯二酚和2，4，6三硝基均苯三酚3種三硝基酚的QuEChERSUPLCMS/MS分析檢測方法。采用改進(jìn)的QuEChERS一步提取凈化的前處理方法處理土壤樣品，未使用緩沖溶液，考察了不同吸附劑的凈化效果，同時簡化了前處理的步驟，本方法可以作為土壤樣品中三硝基酚類多殘留痕量檢測及常規(guī)檢測方法，也可以為土壤及其它沉積物治理、修復(fù)工作研究提供方法依據(jù)。

3Hofmann K W， Knackmuss H J， Heiss G. Appl. Environ. Microbiol.， 2004， 70（5）： 2854-2860

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吳 剛， 董鎖拽， 潘璐璐. 色譜， 2013， 31（7）： 697-702

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徐敦明， 盧聲宇， 陳達(dá)捷. 色譜， 2013， 31（3）： 218-222

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26MorenoGonzlez D， HuertasPérez J F， GarcíaCamtnpa A M. J. Chromatogr. A， 2013， 58（8）1315-1317

27Luzardo O P， RuizSurez N， AlmeidaGonzlez M. Anal. Bioanal. Chem.， 2013， 405（29）： 9523-9536

28Lega F， Contiero L， Biancotto G. Food Addit. Contam. Part A， 2013， 30（6）： 949-957

29YAO MengKan， MA BingLiang， MA YueMing. Journal of Pharmaceutical Analysis， 2010， 12（5）： 2436-2440

姚夢侃， 馬秉亮， 馬越鳴. 藥物分析雜志， 2010， 12（5）： 2436-2440

AbstractA simple， rapid sensitive and accurate ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometric （UPLCMS/MS） method was developed for the simultaneous determination of 2，4，6trinitrophenol， trinitroresorcinate， trinitrophloroglucinol residues in soil. The sample was pretreated by using the modified QuEChERS （quick， easy， cheap， effective， rigged， and safe） method that completed the extraction and cleanup steps in one procedure. In this none buffer QuEChERS method， samples were extracted with 1% formic acid + acetonitrile， cleaned up with primary graphitized carbon black （GCB） and C18 sorbent， then centrifuged and filtrated before detection. The pretreatment method was simple， rapid and effective and can meet the detection requirements. The UPLCMS/MS method was performed on Waters Accucore PFP （150 mm× 2.1 mm， 2.6 μm） and the column temperature was 30 ℃， the gradient elution with acetonitrile and ammonium acetate as the mobile phase and the flow rate was 0.3 mL/min. The negative electrospray ionization （ESI

Symbolm@@ ） source under the multiple reaction monitoring （MRM） mode and external standard method were used for quantification. The results showed that the correlation coefficients up to 0.9942 were obtained across a concentration range of 0.005-5.0 mg/L. The limits of detection （LOD） ranged from 0.002 to 0.005 mg/kg （S/N=3）. The method was validated with soil samples spiked at three fortification levels （0.01， 0.1 and 1 mg/kg） and recoveries were in the range of 79.3%-94.8% with relative standard deviations （RSD） of 3.1%-6.6%.

KeywordsUltra performance liquid chromatography tandem mass spectrery； 2，4，6Trinitrophenol； 2，4，6Trinitroresorcinate； 2，4，6Trinitrophloroglucinol； QuEChERS method； Soil

武 杰， 曹 磊， 李英明. 色譜， 2004， 22（5）： 562

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AbstractA simple， rapid sensitive and accurate ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometric （UPLCMS/MS） method was developed for the simultaneous determination of 2，4，6trinitrophenol， trinitroresorcinate， trinitrophloroglucinol residues in soil. The sample was pretreated by using the modified QuEChERS （quick， easy， cheap， effective， rigged， and safe） method that completed the extraction and cleanup steps in one procedure. In this none buffer QuEChERS method， samples were extracted with 1% formic acid + acetonitrile， cleaned up with primary graphitized carbon black （GCB） and C18 sorbent， then centrifuged and filtrated before detection. The pretreatment method was simple， rapid and effective and can meet the detection requirements. The UPLCMS/MS method was performed on Waters Accucore PFP （150 mm× 2.1 mm， 2.6 μm） and the column temperature was 30 ℃， the gradient elution with acetonitrile and ammonium acetate as the mobile phase and the flow rate was 0.3 mL/min. The negative electrospray ionization （ESI

Symbolm@@ ） source under the multiple reaction monitoring （MRM） mode and external standard method were used for quantification. The results showed that the correlation coefficients up to 0.9942 were obtained across a concentration range of 0.005-5.0 mg/L. The limits of detection （LOD） ranged from 0.002 to 0.005 mg/kg （S/N=3）. The method was validated with soil samples spiked at three fortification levels （0.01， 0.1 and 1 mg/kg） and recoveries were in the range of 79.3%-94.8% with relative standard deviations （RSD） of 3.1%-6.6%.

KeywordsUltra performance liquid chromatography tandem mass spectrery； 2，4，6Trinitrophenol； 2，4，6Trinitroresorcinate； 2，4，6Trinitrophloroglucinol； QuEChERS method； Soil

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AbstractA simple， rapid sensitive and accurate ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometric （UPLCMS/MS） method was developed for the simultaneous determination of 2，4，6trinitrophenol， trinitroresorcinate， trinitrophloroglucinol residues in soil. The sample was pretreated by using the modified QuEChERS （quick， easy， cheap， effective， rigged， and safe） method that completed the extraction and cleanup steps in one procedure. In this none buffer QuEChERS method， samples were extracted with 1% formic acid + acetonitrile， cleaned up with primary graphitized carbon black （GCB） and C18 sorbent， then centrifuged and filtrated before detection. The pretreatment method was simple， rapid and effective and can meet the detection requirements. The UPLCMS/MS method was performed on Waters Accucore PFP （150 mm× 2.1 mm， 2.6 μm） and the column temperature was 30 ℃， the gradient elution with acetonitrile and ammonium acetate as the mobile phase and the flow rate was 0.3 mL/min. The negative electrospray ionization （ESI

Symbolm@@ ） source under the multiple reaction monitoring （MRM） mode and external standard method were used for quantification. The results showed that the correlation coefficients up to 0.9942 were obtained across a concentration range of 0.005-5.0 mg/L. The limits of detection （LOD） ranged from 0.002 to 0.005 mg/kg （S/N=3）. The method was validated with soil samples spiked at three fortification levels （0.01， 0.1 and 1 mg/kg） and recoveries were in the range of 79.3%-94.8% with relative standard deviations （RSD） of 3.1%-6.6%.

KeywordsUltra performance liquid chromatography tandem mass spectrery； 2，4，6Trinitrophenol； 2，4，6Trinitroresorcinate； 2，4，6Trinitrophloroglucinol； QuEChERS method； Soil