元 艷， 方 靜， 廖婷彬， 崔 雪， 陳 玥

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014)

鴨胸腺內(nèi) Ghrelin免疫組織化學(xué)的定位分布及發(fā)育性變化

元 艷， 方 靜， 廖婷彬， 崔 雪， 陳 玥

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014)

【目的】研究Ghrelin在鴨胸腺發(fā)育過(guò)程中的定位分布及變化規(guī)律，以期為進(jìn)一步探討Ghrelin對(duì)胸腺生理功能的影響提供形態(tài)學(xué)資料.【方法】選用不同發(fā)育階段的天府肉鴨，胚胎期分7個(gè)組，即：14、16、18、20、22、24和26 d胚齡組；胚后期分12個(gè)組，即：新生雛、1、3、5、8、11、14、17、20、26、29和32周齡組.運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)及形態(tài)計(jì)量方法研究Ghrelin在鴨胸腺發(fā)育過(guò)程中的定位分布及變化規(guī)律.【結(jié)果和結(jié)論】Ghrelin免疫陽(yáng)性細(xì)胞彌散分布于20 d胚齡至胚后32周齡的胸腺小葉皮質(zhì)和髓質(zhì)；陽(yáng)性細(xì)胞呈圓形、卵圓形、星形或不規(guī)則形，主要為胸腺上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞.陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在胚胎期無(wú)明顯差異，在胚后胸腺繼續(xù)發(fā)育期(新生雛～8周齡)和成熟期(11～17周齡)呈波浪狀變化，在退化期(20～32周齡)呈下降趨勢(shì).說(shuō)明在天府肉鴨胸腺個(gè)體發(fā)育中存在Ghrelin免疫陽(yáng)性細(xì)胞，其數(shù)量表現(xiàn)出明顯增齡變化特性，與胸腺退化密切相關(guān).

Ghrelin； 鴨； 胸腺； 發(fā)育； 免疫組織化學(xué)

Ghrelin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種28肽，為生長(zhǎng)激素促分泌素受體(Growth hormone secretagogue receptor, GHS-R)天然的內(nèi)源性配體[1].當(dāng)Ghrelin與其特異性受體結(jié)合之后，不僅能刺激垂體前葉釋放生長(zhǎng)激素(Growth hormone，GH)[2]，還能刺激食欲及提高采食量，調(diào)節(jié)能量代謝、生殖和糖代謝，改善心血管功能等[3-6].Ghrelin及其GHS-R不僅廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官組織中，還廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞包括T、B 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，從而發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用[7-8]：如Ghrelin可影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生及抗細(xì)胞凋亡的作用[8]；注射Ghrelin 可改善老齡小鼠胸腺的結(jié)構(gòu)及胸腺細(xì)胞的數(shù)量以及增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞從胸腺中的輸出[9-10]；通過(guò)促進(jìn)GH分泌的作用間接調(diào)節(jié)免疫功能等[8].目前，已有研究顯示Ghrelin在小鼠、兔、人和雞胸腺中均有表達(dá)[10-14].本文運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)及形態(tài)計(jì)量方法研究了Ghrelin在天府肉鴨胸腺胚胎及胚后發(fā)育過(guò)程中的定位分布及變化規(guī)律，以期為進(jìn)一步探討Ghrelin 對(duì)胸腺生理功能的影響提供形態(tài)學(xué)資料.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選用不同發(fā)育階段的天府肉鴨(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)種鴨場(chǎng)提供)，胚胎期分7個(gè)組，即：14、16、18、20、22、24和26 d胚齡各一組；胚后期分12個(gè)組，即：0(新生雛)、1、3、5、8、11、14、17、20、26、29和32周齡各一組.胚胎期不分性別，胚后各期均為雌鴨，每組動(dòng)物標(biāo)本數(shù)為4只.

1.2 石蠟切片

采取動(dòng)物的胸腺，固定于體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋等過(guò)程，最后切片，片厚5 μm.

1.3 蘇木素和伊紅染色(H.E)

石蠟切片脫蠟后，常規(guī)H.E染色，鏡檢，觀(guān)察胸腺發(fā)育的一般組織結(jié)構(gòu).

1.4 免疫組織化學(xué)染色

1.4.1 主要試劑 兔抗Ghrelin多克隆抗體(一抗)，SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒，DAB顯色試劑盒(均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品).

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色方法 按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體操作如下：石蠟切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水， 然后將切片置入體積分?jǐn)?shù)為3%H2O21份與蒸餾水10份的混合液中，室溫孵育5～10 min.將切片浸入0.01 mol/L 枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)，微波爐加熱抗原熱修復(fù)，滴加體積分?jǐn)?shù)為5% BSA封閉液，室溫20 min，滴加1∶100稀釋的一抗，4 ℃條件下過(guò)夜.滴加生物素化標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min，滴加試劑SABC，37 ℃孵育30 min后DAB顯色.以上各步驟均用PBS沖洗.蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀(guān)察，免疫陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色.同時(shí)另用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照.

1.5 顯微定量分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每個(gè)組織切片標(biāo)本在Olympus CX21光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察；在400倍下隨機(jī)選取10個(gè)視野用于NikonDS-Ri1數(shù)碼顯微攝影系統(tǒng)(每個(gè)視野相當(dāng)于0.064 mm2)拍照，然后進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(江蘇捷達(dá)801形態(tài)分析軟件).試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 胸腺胚胎和胚后發(fā)育的組織結(jié)構(gòu)

14 d胚齡，胸腺分葉不明顯，其實(shí)質(zhì)主要由胸腺上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等構(gòu)成(圖1a).16 d胚齡，胸腺組織已分化出胸腺小葉.18和20 d胚齡，胸腺實(shí)質(zhì)中淋巴細(xì)胞增多，胸腺小葉增大.22 d胚齡，胸腺小葉的皮質(zhì)及髓質(zhì)開(kāi)始分化，髓質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)彌散胸腺小體(Diffuse Hassall corpuscle, DHC)，由數(shù)量不等的胸腺上皮細(xì)胞集聚形成.24 d胚齡，胸腺小葉增大，髓質(zhì)中可見(jiàn)典型胸腺小體即哈索爾小體(Hassall corpuscle，HC)，由胸腺上皮細(xì)胞呈同心圓排列，中央的胸腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)強(qiáng)嗜酸性，出現(xiàn)角化(圖1b).26 d胚齡，胸腺組織結(jié)構(gòu)基本發(fā)育完善(圖1c).新生雛胸腺小葉的皮質(zhì)和髓質(zhì)增寬.胚后1～5周齡，胸腺小葉顯著增大，皮質(zhì)和髓質(zhì)明顯增寬(圖1d).8周齡胸腺小葉繼續(xù)增大，但增大幅度較小.11～17周齡，胸腺組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化(圖1e).20～32周齡，胸腺小葉萎縮變??；DHC增大，內(nèi)含大量強(qiáng)嗜伊紅的細(xì)胞碎片(圖1f).因此，天府肉鴨胸腺胚后期0～8周齡為繼續(xù)發(fā)育期，11～17周齡為成熟持續(xù)期，20～32周齡為退化期.

DHC: 彌散胸腺小體； C: 胸腺小葉皮質(zhì)； M: 胸腺小葉髓質(zhì).

A：14 d胚齡胸腺(箭頭)，標(biāo)尺=20 μm；b：24 d胚齡胸腺示典型胸腺小體(箭頭)，標(biāo)尺=20 μm；c：26 d胚齡胸腺，標(biāo)尺=20 μm；d：胚后3周齡胸腺，標(biāo)尺=40 μm；e：胚后14周齡胸腺，典型胸腺小體(箭頭)，標(biāo)尺=20 μm；f：胚后26周齡胸腺，標(biāo)尺=40 μm.

圖1 發(fā)育中的胸腺組織結(jié)構(gòu)(H.E 染色)
Fig.1 The histological structure of thymic development(H.E staining)

2.2 免疫組織化學(xué)染色

顯微定量結(jié)果顯示Ghrelin免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在胚胎期無(wú)明顯變化，在胚后繼續(xù)發(fā)育期和成熟期呈波浪狀變化，在退化期呈下降趨勢(shì)，其具體表現(xiàn)為：胸腺小葉皮質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在20 d胚齡～0周齡恒定(P>0.05)，0～3周齡上升(P<0.05)，3～11周齡恒定(P>0.05)，14周齡下降(P<0.05)，17周齡上升并達(dá)其峰值(P<0.05)，隨后呈下降趨勢(shì)，并于29和32周齡達(dá)最低.胸腺小葉髓質(zhì)中Ghrelin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與皮質(zhì)變化規(guī)律相似，但在26 d胚齡～1周齡上升(P<0.05).此外，在同一年齡組中，皮質(zhì)與髓質(zhì)之間陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在20～26 d胚齡、3～14周齡以及29～32周齡差異不顯著(P>0.05)，但在0～1周齡以及17～26周齡皮質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均明顯低于髓質(zhì)(P<0.05)(表1).Ghrelin免疫陽(yáng)性細(xì)胞最早出現(xiàn)在20 d胚齡，隨后在各組胸腺中均可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞(圖2a～2k)，陽(yáng)性信號(hào)定位于胞質(zhì)和胞膜.Ghrelin陽(yáng)性細(xì)胞散在分布于胸腺小葉皮質(zhì)和髓質(zhì)，呈圓形、卵圓形、星形、梭形和不規(guī)則形，主要為胸腺上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞.其中，胸腺上皮細(xì)胞包括被膜下上皮細(xì)胞(圖2a，2b)、皮質(zhì)上皮細(xì)胞(圖2c)、髓質(zhì)上皮細(xì)胞(圖2d)和HC中外圍上皮細(xì)胞(圖2e).但DHC中胸腺上皮細(xì)胞呈陰性反應(yīng)(圖2i，2k).在陰性對(duì)照片中，未見(jiàn)棕黃色免疫陽(yáng)性反應(yīng)(圖2l).

表1各組胸腺中每個(gè)視野Ghrelin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1)

Tab.1Thenumberofghrelin-ircellsintheduckthymus

組別胸腺小葉皮質(zhì)胸腺小葉髓質(zhì)14～18d胚齡組……20d胚齡組9.34±2.53aA9.17±1.13aA22d胚齡組9.56±2.03aA9.49±1.97aA24d胚齡組10.29±1.51aA10.88±2.32aA26d胚齡組10.97±1.30aA11.04±1.82aA0周齡組10.59±1.71aA22.57±4.38bB1周齡組22.86±4.38bA31.69±5.21cB3周齡組30.32±6.45cA29.56±4.70cA5周齡組29.19±3.80cA30.79±6.94cA8周齡組31.39±6.82cA30.03±5.30cA11周齡組30.87±5.20cA30.11±4.87cA14周齡組21.93±3.28bA23.02±4.21bA17周齡組39.35±6.24dA43.67±5.73dB20周齡組30.96±5.19cA35.50±7.37eB26周齡組23.31±4.85bA29.79±5.30cB29周齡組6.32±2.29eA5.98±1.21fA32周齡組5.78±1.44eA5.19±1.82fA

1) 每個(gè)視野相當(dāng)于0.064 mm2，表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, 同列數(shù)據(jù)后凡是有一個(gè)相同小寫(xiě)字母者，表示差異不顯著(P>0.05, Duncan’s 法)；同行數(shù)據(jù)后凡是有一個(gè)相同大寫(xiě)字母者，表示差異不顯著(P>0.05,t檢驗(yàn)).

DHC: 彌散胸腺小體；A: 小動(dòng)脈.

A：被膜下上皮細(xì)胞呈Ghrelin 免疫陽(yáng)性反應(yīng) (箭頭)， 標(biāo)尺=15 μm；b：小動(dòng)脈周?chē)荒は律掀ぜ?xì)胞呈Ghrelin 免疫陽(yáng)性反應(yīng)(箭頭)，標(biāo)尺=15 μm； c：皮質(zhì)上皮細(xì)胞呈Ghrelin 免疫陽(yáng)性反應(yīng) (箭頭)， 標(biāo)尺=10 μm；d：髓質(zhì)上皮細(xì)胞呈Ghrelin 免疫陽(yáng)性反應(yīng)(箭頭)，標(biāo)尺=10 μm；e：HC外圍上皮細(xì)胞呈Ghrelin 免疫陽(yáng)性反應(yīng)(箭頭)，標(biāo)尺=10 μm；f：26 d胚齡胸腺小葉皮質(zhì)Ghrelin 免疫陽(yáng)性細(xì)胞(箭頭)，標(biāo)尺=20 μm；g：3周齡胸腺小葉皮質(zhì)Ghrelin 免疫陽(yáng)性細(xì)胞(箭頭)，標(biāo)尺=20 μm；h：8周齡胸腺小葉髓質(zhì)Ghrelin 免疫陽(yáng)性細(xì)胞(箭頭)，標(biāo)尺=20 μm；i：17周齡胸腺小葉髓質(zhì)Ghrelin 免疫陽(yáng)性細(xì)胞(箭頭)，DHC呈陰性反應(yīng)(箭頭)，標(biāo)尺=20 μm；j：29周齡胸腺小葉皮質(zhì)Ghrelin 免疫陽(yáng)性細(xì)胞(箭頭)，標(biāo)尺=20 μm；k：29周齡胸腺小葉髓質(zhì)Ghrelin 免疫陽(yáng)性細(xì)胞(箭頭)，DHC呈陰性反應(yīng)(箭頭)，標(biāo)尺=20 μm； l：5周齡胸腺陰性對(duì)照，標(biāo)尺=20 μm.

圖2 胸腺Ghrelin免疫組織化學(xué)染色
Fig.2 Immunohistochemical reactions of ghrelin in the thymus

3 討論

前人研究表明Ghrelin在正常動(dòng)物胸腺內(nèi)廣泛表達(dá).在人胸腺內(nèi)，胸腺小葉皮質(zhì)的巨噬細(xì)胞、皮髓交界區(qū)的上皮性網(wǎng)狀細(xì)胞，髓質(zhì)內(nèi)的樹(shù)突狀細(xì)胞、上皮性網(wǎng)狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以及組成胸腺小體的上皮性網(wǎng)狀細(xì)胞均呈Ghrelin免疫陽(yáng)性反應(yīng)[11].小鼠胸腺中存在大量Ghrelin 免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，主要分布于髓質(zhì)，而皮質(zhì)中只有少量零星分布的陽(yáng)性細(xì)胞，這些陽(yáng)性細(xì)胞為胸腺上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和胸腺小體[12].在兔胸腺中，Ghrelin陽(yáng)性細(xì)胞分布于胸腺小葉皮質(zhì)和髓質(zhì)中[13].在雞胸腺中，胸腺上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及胸腺小體呈Ghrelin陽(yáng)性反應(yīng)[14].本試驗(yàn)結(jié)果顯示天府肉鴨胸腺在20 d胚齡～32周齡存在Ghrelin陽(yáng)性細(xì)胞，它們分布于胸腺小葉皮質(zhì)和髓質(zhì)，呈圓形、卵圓形、星形、梭形和不規(guī)則形，主要為胸腺上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞.其中胸腺上皮細(xì)胞包括被膜下上皮細(xì)胞、皮質(zhì)上皮細(xì)胞、髓質(zhì)上皮細(xì)胞和HC中外圍上皮細(xì)胞.說(shuō)明Ghrelin在鴨胸腺內(nèi)的表達(dá)細(xì)胞主要為非淋巴細(xì)胞，這與人[11]、小鼠[12]和雞[14]基本相似.

目前有關(guān)Ghrelin在胸腺中的動(dòng)態(tài)表達(dá)僅見(jiàn)少量報(bào)道.Vishwa等[10]通過(guò)免疫組化和RT-PCR方法研究了2、4、12、18月齡小鼠胸腺中Ghrelin的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該分子在2和4月齡小鼠胸腺中表達(dá)較高，而在12和18月齡中表達(dá)減少.李月等[13]采用RT-PCR方法研究了1、3、6、12月齡兔胸腺中Ghrelin mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示該基因表達(dá)量在1、3月齡較高，在6、12月齡較低.魏鳳梅等[14]通過(guò)免疫組化方法研究發(fā)現(xiàn)雞胸腺中Ghrelin免疫陽(yáng)性細(xì)胞的Ghrelin表達(dá)量在胚后2～30日齡逐漸增加，在44和58日齡有所下降.本研究結(jié)果顯示天府肉鴨胸腺中Ghrelin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在胚胎期恒定，在胚后繼續(xù)發(fā)育期和成熟期呈波浪狀變化，在退化期呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明Ghrelin在天府肉鴨胸腺個(gè)體發(fā)育中表現(xiàn)出明顯的增齡變化特性.這一變化規(guī)律是否與胸腺的生長(zhǎng)、發(fā)育及退化相關(guān)值得進(jìn)一步研究.但就目前有關(guān)Ghrelin的研究情況來(lái)看，其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在鴨胸腺退化期呈下降趨勢(shì)，至少說(shuō)明該分子與胸腺的退化有關(guān)，其依據(jù)是增齡過(guò)程中神經(jīng)肽分泌的變化與胸腺退化密切相關(guān)[15]；小鼠胸腺內(nèi)Ghrelin不足表現(xiàn)為增齡性退化加速，而Ghrelin灌注一定程度上可逆轉(zhuǎn)與年齡相關(guān)的胸腺退化[10];Ghrelin及其受體表達(dá)于小鼠胸腺并隨年齡的增長(zhǎng)而減少，Ghrelin可能是抗衰老的因子，并具有延緩衰老時(shí)免疫系統(tǒng)衰退的效果[10，16]；Ghrelin可影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生及抗細(xì)胞凋亡的作用[8]；Ghrelin具有促進(jìn)GH分泌的作用，而GH具有十分顯著的免疫調(diào)節(jié)功能，如促進(jìn)胸腺T淋巴細(xì)胞增殖分化，抗免疫細(xì)胞凋亡等[8].

HC是胸腺中的一個(gè)重要結(jié)構(gòu), 有研究表明HC可分泌多種肽類(lèi)物質(zhì)[17-18].本試驗(yàn)結(jié)果顯示在胚胎及胚后發(fā)育期，HC外圍胸腺上皮細(xì)胞呈Ghrelin免疫陽(yáng)性反應(yīng)，這與人[11]、鼠[12]、雞[14]中的研究結(jié)果相似，進(jìn)一步證實(shí)HC具有分泌肽類(lèi)物質(zhì)的功能，是胸腺基質(zhì)中的重要組成成分.由于HC位于胸腺髓質(zhì)，推測(cè)其表達(dá)的Ghrelin主要通過(guò)旁分泌、內(nèi)分泌等作用方式參與成熟T淋巴細(xì)胞的功能調(diào)節(jié).

綜上所述, 在天府肉鴨胸腺個(gè)體發(fā)育中存在Ghrelin免疫陽(yáng)性細(xì)胞，其數(shù)量表現(xiàn)出明顯的增齡變化特性，與胸腺的退化密切相關(guān).

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【責(zé)任編輯柴 焰】

Immunohistochemicallocalizationanddevelopmentalchangesofghrelinintheduckthymus

YUAN Yan, FANG Jing, LIAO Tingbin, CUI Xue, CHEN Yue

(College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

【Objective】 The immunohistochemical localization and developmental changes of ghrelin in the duck thymus were studied to provide the morphological effect of ghrelin on the physiological function of thymus.【Method】 Tianfu ducks were divided into 19 groups as follows: 7 groups in the embryonic period (14, 16, 18, 20, 22, 24 and 26 days at embryonic stage), 12 groups after hatching (at neonatal stage, 1, 3, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 26, 29 and 32 weeks).The immunohistochemical method associated with morphometric analysis was used.【Result and conclusion】 The ghrelin immunoreactivity (-ir) cells with round, ovoid, stellate and irregular aspects were maily thymic epitheilial cells and macrophages, and diffusely distributed in the thymic cortex and medulla from embryonic 20 days to 32 weeks after hatching.The number of ghrelin-ir cells in the thymic cortex and medulla was unchanged during the embryonic development, presenting a wave-changed pattern during the continuous development (from neonatal stage to 8 weeks after hatching) and matured periods (from 11 to 17 weeks after hatching ), which decreased during the involution stage (from 20 to 32 weeks after hatching).These results suggested that ghrelin-ir cells existed in the duck thymus and their numbers exhibited obvious age-related changes, which can be closely related to the involution of the duck thymus.

ghrelin; duck; thymus; development; immunohistochemistry

2013- 11- 23優(yōu)先出版時(shí)間2014- 07- 21

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20141003.1225.014.html

元 艷(1987—)，女，碩士研究生，E-mail: yuanyan8507@sina.com；通信作者：方 靜(1963—)，女，博士，教授，E-mail：fangjing4109@163.com

教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(0848)

元 艷， 方 靜， 廖婷彬，等.鴨胸腺內(nèi) Ghrelin免疫組織化學(xué)的定位分布及發(fā)育性變化[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014,35(6):19- 23.

S852.1

A

1001- 411X(2014)06- 0019- 05