王 藝 徐劍鋮 毛 梅 李秋梅 田 靜 蘇 磊

肺泡巨噬細胞(alveolar macrophages,AM))是肺部炎癥反應(yīng)的主要始動細胞，也是脂多糖(lipopolysacharide,LPS)的主要效應(yīng)細胞，其表面表達有多種模式識別受體可以識別結(jié)合LPS，啟動跨膜和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，引起多種炎癥介質(zhì)和細胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的釋放，從而導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)和急性肺損傷(acute lung injury，ALI)[1-3]。核仁素(nucleolin，由C23基因編碼)是真核細胞核仁中含量最豐富的一種蛋白質(zhì)，它是一種穿梭蛋白，可以自由穿梭于細胞核、細胞漿和細胞膜之間，具有多種生物學功能，參與了細胞周期的調(diào)節(jié)，并在病原微生物的感染和自身免疫系統(tǒng)疾病中也發(fā)揮一定的作用[4]。目前大量研究表明核仁素在單核-巨噬細胞系統(tǒng)膜表面廣泛分布并且參與了LPS所致炎癥反應(yīng)[5-8]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)正常大鼠AM膜表面表達有核仁素，體外實驗證實其參與了LPS的內(nèi)化及對AM的激活，它可能是LPS的一種新的膜識別受體[9]。

本實驗擬在體應(yīng)用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)，通過氣管滴入的方法轉(zhuǎn)染針對核仁素的shRNA表達載體，干擾大鼠AM膜核仁素的表達，觀察其對LPS所致ALI大鼠的保護作用，為闡明AM膜核仁素在LPS誘導(dǎo)ALI中的作用及機制提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、試劑和動物

成年清潔級SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心。重組質(zhì)粒pBS-U6.C23shRNA及對照質(zhì)粒pBS-U6.ControlshRNA由美國Ambion公司合成，jetPEITM轉(zhuǎn)染試劑購自法國Polyplus-transfection公司，LPS(E coli O55:B5)購自美國Sigma Invitrogen公司，大鼠TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購自晶美生物科技公司，抗鼠C23抗體、抗NF-κBp65抗體及PVDF膜購自SantaCruz公司，蛋白定量BCA法試劑盒和細胞膜、細胞核蛋白提取試劑盒均為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

二、實驗動物分組

健康雄性SD大鼠40只，隨機分為A組(空白對照組)，B組(ALI組)，C組(轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pBS-U6.C23shRNA并ALI組)，D組(轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pBS-U6.ControlshRNA并ALI組)，每組10只動物。

三、氣管內(nèi)滴注轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒

將100 μg的重組質(zhì)粒pBS-U6.C23shRNA溶于300 μl的生理鹽水中，將200 μg的jetPEITM 溶于300 μl生理鹽水中，將二者混合迅速振蕩混勻溶液(共600 μl)，室溫下孵育20 min后抽入無菌1 ml注射器，待轉(zhuǎn)染。C組大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于鼠板上，消毒切開頸部皮膚，鈍性分離出氣管，將裝有質(zhì)粒DNA 1ml的注射器經(jīng)兩氣管軟骨環(huán)間隙穿刺進入氣管，回抽無阻力并有空氣則證明在氣管內(nèi)，將轉(zhuǎn)染液體緩慢推入。推注完畢后，拔出注射器，立即將鼠板直立旋轉(zhuǎn)，使氣管內(nèi)的液體均勻分布至兩肺，最后消毒縫合切口，等待復(fù)蘇。蘇醒后的大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)待建立LPS致ALI的動物模型。同法，將D組大鼠經(jīng)氣管內(nèi)滴入轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pBS-U6.ControlshRNA 100 μg。

四、LPS致ALI模型建立

轉(zhuǎn)染48 h后，B、C、D組大鼠經(jīng)尾靜脈緩慢注射LPS(E coli O55:B5)5 mg/kg，A組大鼠經(jīng)尾靜脈緩慢注射生理鹽水，15 min注射完畢。觀察大鼠自主呼吸，實驗在注射LPS 4 h后結(jié)束。

五、觀察指標及方法

各組動物致傷后4 h，做如下實驗：①ELISA測定大鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中TNF-α及IL-6的含量：無菌條件下收集BALF，按TNF-α及IL-6 ELISA檢測試劑盒說明書操作檢測BALF中TNF-α及IL-6蛋白的濃度，用酶標儀在450 nm處測吸光值；②Western blot檢測AM膜核仁素蛋白表達：BALF離心沉淀用膜蛋白提取試劑提取AM膜蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，后分別加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min，離心后取上清液上樣進行聚丙烯凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的封閉液封閉2 h，一抗(兔抗大鼠C23多克隆抗體，稀釋度1︰500)4 ℃孵育過夜，二抗(羊抗兔IgG/HRP，稀釋度1︰1000)37 ℃孵育1 h，洗膜后用化學發(fā)光試劑顯色；③EMSA檢測NF-κB活性：提取大鼠AM核蛋白，將核提取物、生物素標記特異性探針和結(jié)合反應(yīng)液等混合制成結(jié)合反應(yīng)體系，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜、化學發(fā)光反應(yīng)，應(yīng)用Quantity One圖像分析軟件測定各條帶積分光密度值表示核提取物中NF-KB的活性，同時進行特異性與非特異性競爭試驗；④左下肺組織固定后石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察。

五、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、肺組織病理學觀察

大鼠肺組織病理變化，見圖1。A組肺泡腔結(jié)構(gòu)、完整，無明顯病理變化，組間無顯著差異；B組肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，部分肺泡腔變小，肺泡間隔增厚，間質(zhì)增生，可見較多的炎性細胞浸潤；C組肺泡結(jié)構(gòu)仍有破壞，但較B組損傷有減輕，部分肺泡壁增厚，肺間質(zhì)增生減輕，浸潤的炎性細胞減少，與B組相比炎癥有減輕；而D組與B組病理變化無明顯差異。

注：A：對照組; B：LPS處理組;C：LPS+pBS-U6.C23 shRNA組;D：LPS+pBS-U6.ControlshRNA組

二、AM膜核仁素蛋白表達

經(jīng)LPS處理后，B組及D組的大鼠AM膜核仁素蛋白表達顯著增加，與A組相比，組間有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；C組大鼠AM膜核仁素蛋白表達明顯下調(diào)，與B組相比，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而D組與B組中的大鼠AM膜核仁素蛋白表達組間差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)，見圖2。

注：A：對照組; B：LPS處理組; C：LPS+pBS-U6.C23shRNA組;D：LPS+pBS-U6.ControlshRNA組；﹡P<0.01與對照組比較；△P<0.01 與LPS組比較

三、AM中NF-κB活性變化

對照組大鼠AM中NF-κB活性較弱，經(jīng)LPS處理后，各組大鼠AM中NF-κB活性顯著增加，與A組相比，組間差異非常明顯(P<0.01)。C組大鼠AM中NF-κB活性明顯降低，與B組比較，差異顯著(P<0.05)；而D組與B組比較，組間無明顯差異(P>0.05)，見圖3。

四、BALF中TNF-α 和IL-6的含量

經(jīng)LPS誘導(dǎo)肺損傷后，顯著增加了大鼠BALF中促炎因子TNF-α 和IL-6的表達，各組和A組相比差異顯著(P<0.01)；C組大鼠BALF中TNF-α 和IL-6的含量顯著降低，與B組相比差異顯著(P<0.01)；而D組與B組相比，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

注：A：對照組；B：LPS處理組；C：LPS+pBS-U6.C23shRNA組；D：LPS+pBS-U6.ControlshRNA組；﹡P<0.01 與對照組比較；△P<0.05 與LPS組比較

注：A：對照組；B：LPS處理組；C：LPS+pBS-U6.C23shRNA組；D：LPS+pBS-U6.ControlshRNA組；﹡P<0.01 與對照組比較；△P<0.01 與LPS組比較

討 論

AM是肺先天免疫系統(tǒng)中的前衛(wèi)細胞，是接觸抗原最早、機會最多的細胞，也是LPS的靶細胞。其表面多種膜受體和膜分子如CD14、Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)、β2整合素(CD11/CD18)以及甘露糖受體(mannose receptor,CD206)等均參與了LPS的識別及信號傳導(dǎo)，但阻斷這些受體并不能完全抑制炎癥因子的釋放和減輕肺損傷，提示還有其他膜受體存在的可能性；并且LPS還可能與某些膜受體結(jié)合并被轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)，直接激活細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)[10]。因此，進一步明確LPS的膜結(jié)合受體及信號傳導(dǎo)機制，有利于闡明LPS致ALI的發(fā)病機制及尋找新的治療靶點。

核仁素以磷酸化的形式存在于細胞膜表面，已知它在單核-巨噬細胞膜表面有表達并且具有與糖蛋白中的多糖鏈結(jié)合的特性[11-14]，依據(jù)這一特性同時由于LPS分子結(jié)構(gòu)中含有O-側(cè)鏈多糖，有學者提出單核巨噬細胞膜核仁素可能識別LPS而參與LPS所致炎癥反應(yīng)的假說。方立等[5]發(fā)現(xiàn)核仁素存在于人外周血單核細胞(THP-1)膜表面，抗核仁素抗體可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的早期炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β的表達與分泌。在內(nèi)毒素血癥小鼠的肺組織和RAW264.7 細胞炎癥模型中，相對分子量為110×103的核仁素表達上調(diào)，相對分子量為80×103的核仁素片段表達減少，在核仁素過表達組LPS所致的IL -1β釋放明顯增加；而在核仁素低表達組LPS所致的IL -1β釋放明顯減少[6]。近來研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌感染人THP-1單核細胞時伴有核仁素表達上調(diào)；LPS誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細胞活化時伴有核仁素裂解片段的表達下調(diào)[7-8]。我們前期的實驗發(fā)現(xiàn)大鼠AM膜核仁素在LPS的識別和信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，但其具體的結(jié)合機制和信號傳導(dǎo)機制尚未明確[9]。

由于AM膜核仁素分子處于LPS信號識別和轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游環(huán)節(jié)，如果能減少膜核仁分子表達和或抑制膜核仁分子的生物學作用，則有可能從上游環(huán)節(jié)入手來阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，避免產(chǎn)生過度的炎癥反應(yīng)，從而在LPS所致的ALI發(fā)病早期開展有效的抗炎治療。我們采用RNA干擾技術(shù)，來沉默目的基因。基于ALI的器官特異性，我們選擇了氣管內(nèi)滴入的方法轉(zhuǎn)染pBS -U6C23shRNA質(zhì)粒。實驗結(jié)果證實了jetPEITM體內(nèi)轉(zhuǎn)染shRNA的高效性和安全性，與對照組相比，BALF中AM膜核仁素蛋白表達明顯下降，干擾效率達到72%同時也說明通過氣道轉(zhuǎn)染的方法是安全可行的。實驗中我們對比分析了各組大鼠BALF中的TNF-α和IL-6的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予氣管內(nèi)轉(zhuǎn)染pBS-U6C23shRNA質(zhì)粒后，BALF中的TNF-α和IL-6蛋白表達水平均明顯降低，NF-κB的活性也明顯下降，進一步在體內(nèi)實驗中證實了RNA干擾對膜核仁素介導(dǎo)的LPS信號傳導(dǎo)具有明顯的阻斷作用。其次，我們還發(fā)現(xiàn)氣管內(nèi)滴入的方法轉(zhuǎn)染pBS-U6C23shRNA質(zhì)粒后，一定程度上可以改善、緩解肺的病理損傷，說明核仁素RNA干擾在一定程度上減輕了肺損傷，減輕了肺部炎癥，提示AM膜核仁素在LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI的發(fā)病過程中起到一定作用。RNA干擾可以通過抑制AM膜核仁素表達，減少LPS內(nèi)化入AM，降低NF-κB活性，減少分泌TNF-α和IL-6炎癥因子，減輕肺損傷，因此，沉默核仁素基因有望成為防治LPS所致ALI的有效手段之一。

沉默核仁素基因可通過阻斷AM信號通路來減輕炎癥反應(yīng)，從而可能對LPS所致的ALI起到保護作用。但由于本研究以實驗動物作為載體，具有一定的局限性，尚需進一步的臨床實驗為防治LPS所致的ALI提供更有力的實驗依據(jù)。

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