★ 許可為 陳麗華 朱若凱 蔡佳 管詠梅

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科 江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江西 南昌 330004；3.江西省醫(yī)藥采購(gòu)服務(wù)中心 江西 南昌 330029)

雷公藤屬衛(wèi)矛科植物，被傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為具有活血化瘀、清熱解毒、消腫散結(jié)、殺蟲止血等功效[1]。雷公藤在治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎方面的療效尤為顯著，但其口服制劑在長(zhǎng)期服用的情況下毒性很大[2-4]。雷公藤貼劑相比較口服制劑可以避免首過效應(yīng)、降低毒性及不良反應(yīng)、減少服藥次數(shù)并延長(zhǎng)作用時(shí)間[5]。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[6,7]，本研究將雷公藤提取物制備成粘膠分散型貼劑，通過薄層色譜法對(duì)貼劑處方中的主要有效成分雷公藤甲素進(jìn)行鑒別，并采用高效液相色譜法對(duì)雷公藤甲素進(jìn)行含量測(cè)定，為雷公藤粘膠分散型貼劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 電子天平(BT25S，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；超聲波清洗器(KQ3200E，昆山市超聲儀器有限公司)；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9140MBE，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；實(shí)驗(yàn)用精密涂布機(jī)(TB-04D，天津鍇凱科技有限公司)；高效液相色譜儀(Agilent1200，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；Phenomenox C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 雷公藤提取物(桂林市三棱生物制品有限公司，批號(hào)：20120629)；雷公藤甲素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111567-200502)；硬脂酸鎂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20111108)；色譜甲醇(美國(guó)TEDIA天地試劑有限公司)；氮酮(福建壽寧美菲思生物化學(xué)品廠)；丙二醇(分析純，西隴化工股份有限公司)；無水乙醇(分析純，上海振興化工一廠)；雙蒸水(實(shí)驗(yàn)室自制)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 雷公藤粘膠分散型貼劑的制備 稱取處方比例的雷公藤提取物、氮酮、丙二醇、硬脂酸鎂、無水乙醇等；攪拌均勻后，室溫靜置2h以脫除氣泡，于涂布機(jī)上進(jìn)行涂布，涂布完成后室溫放置1h；隨后于80℃下烘15min以除去有機(jī)溶劑，取出后趁熱壓上背襯即得雷公藤粘膠分散型貼劑。

1.雷公藤甲素對(duì)照品；2.供試品；3.陰性對(duì)照

2.2 雷公藤甲素的薄層鑒別 取本品0.5g，撕去防粘層并剪成適當(dāng)大小后轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，以20mL無水乙醇超聲提取30min后，提取液以0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾作為TLC供試品溶液；取減壓干燥至恒重的雷公藤甲素對(duì)照品，加無水乙醇制成每1mL中含1mg雷公藤甲素的溶液，作為TLC對(duì)照品溶液；按處方比例稱取缺少雷公藤提取物的其它試劑與輔料，按“2.1”項(xiàng)下方法制備陰性樣品，取陰性樣品0.5g，按照上述TLC供試品溶液制備方法制備TLC陰性對(duì)照品溶液；照薄層色譜法(附錄VI B)試驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一以0.8%羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以氯仿-乙醚(2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以顯色劑(2% 3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液與2 mol/L氫氧化鈉乙醇溶液臨用前按1∶3混合)使顯色，供試品色譜和對(duì)照品色譜在相同位置處應(yīng)顯示相同顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見圖1。

2.3 雷公藤甲素的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenox C18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(45∶55)；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：218nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；色譜見圖2。

A.雷公藤甲素對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照

2.3.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取已經(jīng)干燥至恒重的雷公藤甲素對(duì)照品適量，以45%甲醇水為溶劑進(jìn)行溶解，制備成每1mL含有10μg雷公藤甲素的溶液，備用。

2.3.3 供試品溶液的配制 取本品0.75g，撕去防粘層并剪成適當(dāng)大小后轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，加45%甲醇水溶液200mL，密塞后，超聲提取30min，濾過，將濾液轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，殘?jiān)?5%甲醇水溶液洗滌3次，每次10mL,洗滌液濾過后一并轉(zhuǎn)移至容量瓶中，繼續(xù)添加45%甲醇水溶液至刻度，搖勻后取出適量并以0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.4 陰性對(duì)照溶液的配制 按處方比例稱取除雷公藤提取物之外的試劑與輔料，照“2.1”項(xiàng)下方法制備陰性樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL，分別置于10mL容量瓶中并繼續(xù)添加45%甲醇水溶液至刻度，搖勻，即得雷公藤甲素系列對(duì)照品溶液。精密吸取上述對(duì)照品溶液各20μL，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC含量測(cè)定。以雷公藤甲素的濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=38.583X+0.4088，r=0.9999；結(jié)果表明，雷公藤甲素在0.5～10μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述系列對(duì)照品溶液中的6μg/mL雷公藤甲素對(duì)照品溶液20μL，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果平均峰面積為233.75，RSD=0.48%(n=6)，表明精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.3.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液，照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0，2，4，6，8，10，12 h進(jìn)樣20μL，測(cè)定其峰面積。結(jié)果峰面積均值為115.56，RSD值為1.10%，說明樣品穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次制備的貼劑樣品，照“2.3.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別精密吸取20μL按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果計(jì)算RSD值為0.68%，表明重復(fù)性良好。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表2 貼劑中雷公藤甲素含量測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已經(jīng)測(cè)定雷公藤甲素含量的同批樣品約0.15g共9份，每三份分別精密加入雷公藤甲素對(duì)照品溶液(精密稱取已干燥至恒重的雷公藤甲素對(duì)照品，加甲醇溶解并制備成100μg/mL的溶液)1.28，1.6，1.92mL，照“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.3.10 樣品含量測(cè)定 分別取6個(gè)批次的雷公藤粘膠分散型貼劑樣品各1g，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并測(cè)定不同批次貼劑中的雷公藤甲素含量，結(jié)果見表2。

3 討論

在雷公藤粘膠分散型貼劑的制備過程中，靜置脫氣的時(shí)間和溫度的控制很關(guān)鍵。經(jīng)過考察發(fā)現(xiàn)，一般控制在25℃、2h效果較好，如果溫度過高或者時(shí)間過長(zhǎng)很容易致使壓敏膠混合物粘性太大而無法涂布。

在雷公藤粘膠分散型貼劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂中，雷公藤甲素是雷公藤藥材中的主要有效成分，以雷公藤甲素作為鑒別與含量測(cè)定指標(biāo)。對(duì)于雷公藤甲素的薄層鑒別，參考雷公藤片的部頒標(biāo)準(zhǔn)[8]，顯色劑需要臨用前配置且顯色后應(yīng)立即置于干燥器中保存，否則顯色斑點(diǎn)很快就會(huì)淡化消失。對(duì)于貼劑中雷公藤甲素的含量測(cè)定，采用HPLC含量測(cè)定方法，該方法精確、專屬性強(qiáng)、可靠。

雷公藤甲素含量測(cè)定結(jié)果顯示，1g貼劑中含有1.045mg雷公藤甲素，故暫定貼劑中雷公藤甲素的含量不得低于0.1%。

[1]郭艷紅,譚墾.雷公藤的毒性及其研究概況[J].中藥材,2007,30(1):112-117.

[2]李玉潔,王強(qiáng)狀,鄭曉俊.雷公藤治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)藥師,2004,7(8):639-641.

[3]童靜,馬瑤,吳建元,等.雷公藤長(zhǎng)期毒性作用及其時(shí)間節(jié)律性研究[J].中草藥,2004,27(12):933-935.

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[5]錢麗萍,闕慧卿,林綏,等.雷公藤貼劑中雷公藤內(nèi)酯醇釋放度的測(cè)定[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2011,26(5):403-405.

[6]闕慧卿,錢麗萍,林綏.均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化雷公藤內(nèi)酯醇透皮貼劑的處方研究[J].中草藥,2012,42(12):2 468-2 470.

[7]錢麗萍,闕慧卿,林綏,等.雷公藤內(nèi)酯醇生物貼的穩(wěn)定性研究[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2012,35(3):182-184.

[8]雷公藤片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).衛(wèi)生部頒中藥標(biāo)準(zhǔn)[S].中藥成方制劑第十六冊(cè),WS3-B-3120-98.