申葉春 曹巖 蔡艷霞 張凡

·論著·

不同淋巴結轉移潛能口腔鱗癌細胞株的形態(tài)學分析及流式細胞周期分析的研究

申葉春 曹巖 蔡艷霞 張凡

目的探討口腔鱗癌不同轉移潛能細胞株形態(tài)學的變化，及對細胞周期、凋亡指數(shù)的影響。方法復蘇傳代口腔鱗癌高、低淋巴結轉移潛能細胞株，利用倒置顯微鏡觀察不同細胞株的形態(tài)學差異，采用病理圖像分析系統(tǒng)對兩種不同細胞株的形態(tài)學參數(shù)進行分析；利用免疫細胞化學檢測兩種細胞株中CEA、EMA的表達；流式細胞術檢測培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h時間節(jié)點細胞周期分布差異。結果高淋巴結轉移細胞株呈梭形外形，粘附性較差，隨傳代時間的延長，細胞異型性更加明顯、且梭形變較突出；低淋巴結轉移細胞株呈圓形或卵圓形，細胞粘附性差，體積較小，細胞異型性不明顯；高淋巴結轉移細胞株CEA、EMA的陽性細胞比率為(84±7)%和(83±5)%，在低淋巴結轉移細胞株中的陽性細胞比率分別為(89±7)%和(81±6)%，兩種指標在不同細胞株中的陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。細胞形態(tài)學圖像分析結果顯示2種細胞株在細胞面積、周長、等效直徑、長徑、短徑高轉移組明顯高于低轉移組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；2組細胞株的細胞變異參數(shù)面積、周長、等效直徑、長徑、短徑高轉移組明顯低于低轉移組(P<0.05)。流式細胞術結果顯示高淋巴結轉移細胞株的細胞凋亡指數(shù)明顯低于低轉移組細胞凋亡指數(shù)(P<0.05)。高淋巴結轉移細胞株G1細胞比值明顯低于低轉移細胞株，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； G2期高低轉移組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；S期明顯高于低淋巴結轉移組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論不同淋巴結轉移潛能的口腔鱗癌細胞株在形態(tài)學參數(shù)方面存在一定的差異，這可能是造成其具有不同轉移潛能的結構基礎；口腔鱗癌細胞株凋亡抑制和細胞合成期比例優(yōu)勢是導致淋巴結轉移的分子基礎。

口腔鱗癌；細胞形態(tài)學；流式細胞術；凋亡指數(shù)；免疫細胞化學

口腔鱗癌的惡性程度取決于其局部浸潤和淋巴結轉移的能力，侵襲臨近組織和遠處淋巴結轉移是導致復發(fā)、放化療不敏感的主要因素，也是常見死因，而細胞形態(tài)學改變和凋亡抑制是導致腫瘤侵襲能力增強、惡性程度增加的原因，與淋巴結轉移間的關系少見報道，本實驗利用細胞培養(yǎng)、免疫細胞化學、流式細胞術檢測口腔鱗癌不同淋巴結轉移潛能細胞株的差異，從形態(tài)和分子機制對淋巴結轉移與凋亡關系進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備 口腔鱗癌淋巴結高轉移細胞株(SCC-LH)、低轉移細胞株(SCC-LL)由北京大學醫(yī)學部口腔醫(yī)學院惠贈。RPMI- 1640細胞培養(yǎng)基(lnvin’ogen公司)；新生小牛血清 (杭州四季青生物工程有限公司)；胰蛋白酶A 、青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司)；二甲基亞砜(DMSO) (美國Sigma公司)；EMA鼠抗人單克隆抗體、CEA鼠抗人單克隆抗體 (北京中杉試劑公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus)；PI粉(美國Sigma公司);AnnexinV-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒 (南京凱基生物)；CO2培養(yǎng)箱 (科俊儀器有限公司)；低溫高速離心機D-78532(德國 Hettich Zentrifugen 公司) FAC Sort 流式細胞儀 (美國BD公司)。

1.2 細胞復蘇 實驗室常規(guī)消毒，紫外照射40 min，培養(yǎng)液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒溫水浴箱37℃預熱20 min，從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入40℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化，將細胞懸液移入15 ml離心管，緩慢加入4 ml培養(yǎng)液，離心(1 000 r/min，5 min)，用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞傳代培養(yǎng) 紫外線照射超凈工作臺30 min，用75%乙醇擦拭雙手，預熱培養(yǎng)液，兩種細胞株均在含10%小牛血清、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 U/ml)雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，溫度37℃、相對濕度90%、體積分數(shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，定期觀察細胞生長情況，每隔2～3 d用0.25%胰酶消化，進行傳代培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察消化細胞，當原貼壁細胞逐漸趨于圓形，細胞質回縮，細胞間不在連接成片時為合適消化程度，加入新的培養(yǎng)液停止消化。用彎頭吸管吸取培養(yǎng)液，反復吹打成細胞懸液，吸出適量細胞懸液分裝到2～3個培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)液后旋緊瓶蓋，以乙醇棉球擦拭外壁適當旋松瓶蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，換液及傳代時間有細胞生長情況而定。

1.4 細胞形態(tài)學圖像分析系統(tǒng) 每張細胞爬片放入95%乙醇中固定15 min，HE染色，置于40倍顯微鏡下觀察，選擇細胞密集重疊較少的區(qū)域采圖， 使用CMIAS真彩色病理圖像分析系統(tǒng)采集細胞涂片的顯微圖像， 然后選擇細胞分布較均勻、細胞邊界清晰的視野采集4～10幅400倍圖片,保證有核細胞200個以上，對有核細胞進行自動分割，輔以手工分割，對分割出的單個細胞進行各種形態(tài)學參數(shù)(面積、周長、等效直徑、長徑、短徑、長短徑比、形狀因子、圓形度、異形指數(shù))自動測量；對不同細胞株間的細胞核、漿的面積、核漿比例、細胞周長、平均直徑、圓度、形狀因子進行分割，編輯，統(tǒng)計，獲得細胞學變異系數(shù)。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期的分布 0.25%胰蛋白酶消化細胞制成細胞懸液，1 000 r/min離心5 min,PBS 洗滌2次，冰乙醇固定,-20℃過夜。取出懸液1 000 r/min離心5 min，棄乙醇固定液，PBS洗滌2次,調整細胞濃度為5×105/ml，加入PI染液1 ml，4℃孵育60 min，200 目鋼篩過濾。以488 nm 氬離子激光激發(fā),應用ModFit LT2.0軟件和CELLQuest 軟件進行細胞周期的檢測和分析。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，制成懸液1 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌細胞2次，調整細胞濃度為(1～5)×105/ml，加入500 μl的Binding Buffer 懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，加入5 μl Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應5～15 min；用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm;發(fā)射波長Em=530 nm。應用CELLQuest軟件進行凋亡數(shù)據(jù)的分析。

2 結果

2.1 不同培養(yǎng)時間不同細胞株的形態(tài)學觀察 高淋巴結轉移細胞株呈梭形排列，粘附性較差，隨傳代時間的延長，細胞異型性更加明顯、且梭形變較突出；低轉移細胞株呈圓形或卵圓形，細胞粘附性差，體積較小，細胞異型性不明顯。見圖1～4。

圖1 高轉移細胞株傳代培養(yǎng)(12 h)(HE×40)

圖2 高轉移細胞株傳代培養(yǎng)(36 h)(HE×40)

圖3 低轉移細胞株傳代培養(yǎng)(12 h)(HE×40)

圖4 低轉移細胞株傳代培養(yǎng)(36 h)(HE×40)

2.2 CEA、EMA單克隆抗體在傳代細胞的表達 傳代細胞均高比例表達CEA、EMA，證明細胞株的傳代培養(yǎng)成功；高淋巴結轉移細胞株中CEA、EMA的陽性細胞比率(84±7)%和(83%±5)%，與低淋巴結轉移細胞株的(89±7)%和(81±6)%比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5、6。

圖5 CEA在癌細胞漿的表達(HE×100)

圖6 EMA在癌細胞膜的表達(HE×100)

2.3 不同細胞株間細胞學形態(tài)參數(shù)和變異系數(shù)的比較 高淋巴結轉移細胞株細胞面積、周長、等效直徑、長徑、短徑明顯高于低轉移組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；長短比、形狀因子、圓形度、異形指數(shù)間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；高轉移細胞株的細胞變異參數(shù)在面積、周長、等效直徑、長徑、短徑間明顯高于低轉移組組(P<0.05)；長短比、形狀因子、圓形度、異形指數(shù)間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、2。

表1 不同細胞株細胞形態(tài)學參數(shù)測定結果比較

表1 不同細胞株細胞形態(tài)學參數(shù)測定結果比較

參數(shù)低轉移細胞株高轉移細胞株t值P值面積(μm2)28.00±13.18152.02±95.015.99420.001周長(μm)18.01±3.5835.55±12.8513.99470.000等效直徑(μm)5.56±1.0610.74±3.796.99150.001長徑(μm)5.90±1.1911.49±4.147.09250.001短徑(μm)5.27±0.9510.05±3.516.82310.002長短比1.11±0.031.14±0.041.89650.1134形狀因子1.06±0.021.08±0.031.00240.1352圓形度0.94±0.020.92±0.022.25250.6219異形指數(shù)3.64±0.033.69±0.042.45010.4512

2.4 2種細胞株不同培養(yǎng)時間的凋亡指數(shù)、細胞周期分布比較 低淋巴結轉移組細胞凋亡指數(shù)，高于高淋巴結轉移細胞株的細胞凋亡指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高轉移細胞株G1期比率明顯低于低轉移細胞株(P<0.05)；G2期比率在2組細胞株間無明顯差異(P>0.05)；S期比率在高轉移細胞株明顯高于低轉移細胞株(P<0.05)。見表3，圖7、8。

表2 不同細胞株細胞形態(tài)學參數(shù)變異系數(shù)比較

表2 不同細胞株細胞形態(tài)學參數(shù)變異系數(shù)比較

參數(shù)低轉移細胞株高轉移細胞株t值P值面積(μm2)0.81±0.471.88±0.819.87620.005周長(μm)0.29±0.140.77±0.255.77130.000等效直徑(μm)0.28±0.140.74±0.248.99020.001長徑(μm)0.29±0.140.74±0.224.78140.05短徑(μm)0.28±0.130.73±0.218.90620.001長短比0.09±0.060.13±0.131.45720.1762形狀因子0.03±0.030.08±0.242.00470.2725圓形度0.03±0.010.08±0.232.13400.2554異形指數(shù)0.02±0.010.06±0.241.63210.3562

表3 不同淋巴結轉移潛能細胞株細胞周期的分布比較

表3 不同淋巴結轉移潛能細胞株細胞周期的分布比較

組別G1G2St值P值高轉移78.4±5.964.20±0.4517.40±4.25tG1=13.79240.001低轉移56.44±4.78 6.40±1.6637.22±5.37tG2=3.42500.2456tS=9.76540.005

圖7 高淋巴結轉移口腔鱗癌細胞株細胞周期分布流式曲線

圖8 低淋巴結轉移口腔鱗癌細胞株細胞周期分布流式曲線

3 討論

口腔鱗癌是頜面部常見的惡性腫瘤，治療方式以手術為主的綜合序列治療模式不斷推廣，盡管腫瘤的局部控制率有了顯著提高，但口腔鱗癌患者的5年生存率仍然維持在50%～55%，無明顯改善，主要原因是局部侵襲和遠處轉移[1，2]。口腔鱗癌患者在局部復發(fā)和遠處轉移等方面存在明顯差異，導致不同的預后，與腫瘤細胞自身不同的異質性和基因組不穩(wěn)定性密切相關。腫瘤的淋巴結轉移始動因素與細胞表面的粘附分子改變以及細胞形態(tài)變異密切相關， 兩者協(xié)同作用導致腫瘤細胞脫離原發(fā)灶進入間質，與間質細胞粘附，侵襲能力增加，同時腫瘤細胞進入間質或血流后受到多種局部微環(huán)境及機體免疫促凋亡因素調控，克服失巢凋亡成為其發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)。Chien等[3]于描述了失巢凋亡這種特殊的凋亡形式，認為正常上皮或內皮細胞存在粘附依賴性，其存活依賴于細胞間和細胞與基質間的信號傳遞，稱之為錨定依賴。如正常上皮或不具備轉移性質的實體瘤細胞從原發(fā)部位脫落進入血流后就會引發(fā)凋亡，稱之為失巢凋亡[3-5]。惡性腫瘤在離開原發(fā)部位后仍能長時間保持存活，其抗失巢凋亡的能力的獲得是腫瘤細胞進行侵襲、轉移的先決條件。惡性腫瘤的這種抗失巢凋亡的特性已經(jīng)在包括肺癌、大腸癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤的體外細胞培養(yǎng)中得到證實，而口腔鱗癌極易出現(xiàn)局部復發(fā)和腫瘤浸潤前沿明顯的異質性也提示腫瘤細胞可能存在抗凋亡特性[6]。本實驗證實：不同淋巴結轉移潛能的細胞株細胞外形存在明顯差別，高淋巴結轉移細胞株細胞粘附性差，外形梭形變明顯，低淋巴結轉移細胞株外形圓形比率較高，同時圖像分析軟件對細胞形態(tài)學指標分析顯示高淋巴結轉移組細胞異型性更加明顯，高淋巴結轉移細胞株細胞面積、周長、等效直徑、長徑、短徑明顯高于低轉移組；長短比、形狀因子、圓形度、異形指數(shù)間比較無明顯差別；高轉移細胞株的細胞變異參數(shù)在面積、周長、等效直徑、長徑、短徑間明顯高于低轉移組組；長短比、形狀因子、圓形度、異形指數(shù)間比較無明顯差別，說明高轉移細胞株的梭形變和粘附力降低是惡性程度增加的形態(tài)學基礎，提示參與上皮間質轉換為間質浸潤提供表面分子表型改變。

腫瘤細胞獲得侵襲轉移能力是完成轉移過程的前提，但并非所有的腫瘤細胞都具有這種能力并完成整個過程，經(jīng)典理論認為轉移是癌細胞高度克隆選擇的過程。腫瘤轉移潛能在原發(fā)瘤階段即已獲得，在進展過程中受到內外界因素的影響而調節(jié)。同時細胞凋亡是一種由基因控制的細胞自主性死亡過程，是在促凋亡因素和抗凋亡因素共同調節(jié)下得以正常進行的，是維持體內環(huán)境穩(wěn)定的重要機制之一。細胞凋亡調節(jié)平衡紊亂與腫瘤的發(fā)生密切相關。因此運用基因增補法將能有效促進腫瘤細胞凋亡的目的基因導入腫瘤細胞，使其表達產(chǎn)物補償缺陷基因的功能或使原有的促凋亡功能得到加強，從而達到治療腫瘤的目的[7-9]。腫瘤細胞在抑制失巢凋亡同時獲得基因型及細胞表型的改變，使其更具侵襲和轉移能力，而細胞周期是最能反映細胞增殖活性改變的客觀指標。本實驗顯示：口腔鱗癌細胞株高淋巴結轉移細胞株的細胞凋亡指數(shù)明顯低于低淋巴結轉移組細胞凋亡指數(shù)(P<0.05)。高轉移細胞株G1期比率明顯低于低轉移細胞株；G2期比率在2組細胞株間無明顯差異(P>0.05)；S期比率在高轉移細胞株明顯高于低轉移細胞株(P<0.05)，說明高淋巴結轉移組細胞明顯處于高代謝狀態(tài)，增殖活性較高，遺傳物質合成占優(yōu)勢，而低淋巴結轉移腫瘤細胞G1期占優(yōu)勢，說明其增殖活性低于高淋巴結轉移組。因此，對細胞凋亡調控因子的研究將有利于探索惡性腫瘤發(fā)生的奧秘，為進一步治療腫瘤奠定基礎。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2014.08.012

075000 河北省張家口市，河北北方學院附屬第一醫(yī)院口腔科

R 78

A

1002-7386(2014)08-1154-04

2013-12-11)