羅光俊，何天容，

(貴州大學(xué)喀斯特環(huán)境與地質(zhì)災(zāi)害防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550003)

貴陽(yáng)市“兩湖一庫(kù)”為貴陽(yáng)市飲用水源地，且都屬季節(jié)性分層水庫(kù)，具有蓄水、供水和防洪等功能.各流域都長(zhǎng)期受到各種工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生活廢水的污染，其中紅楓湖、百花湖已經(jīng)是富營(yíng)養(yǎng)化湖泊[1]，阿哈水庫(kù)由于長(zhǎng)期受到煤礦廢水的污染，其硫酸鹽、鐵、錳含量異常豐富[2].此外，“兩湖一庫(kù)”都遭受到了不同程度的汞污染，尤其在百花湖及其流域，僅在1971-1997年間，接受貴州有機(jī)化工廠排放的汞就達(dá)100多噸.硫酸鹽還原菌(sulfate reducing bacteria， SRB)是一類形態(tài)各異、營(yíng)養(yǎng)類型多樣、能利用硫酸鹽或者其它氧化態(tài)硫化物作為電子受體來異化有機(jī)物質(zhì)的微生物[3].該類微生物參與硫的生物地球化學(xué)過程[4-5]，還在汞的甲基化、苯類的降解以及鈾的轉(zhuǎn)化等環(huán)境毒性污染物的生物轉(zhuǎn)化遷移中起重要作用[6-8]，所以，弄清楚“兩湖一庫(kù)”不同季節(jié)硫酸鹽還原菌的分布規(guī)律，有利于研究者們更好地理解貴陽(yáng)市“兩湖一庫(kù)”中某些污染物的遷移轉(zhuǎn)化尤其是汞的甲基化過程，為正在開展的“兩湖一庫(kù)”治理提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

阿哈水庫(kù)是位于貴陽(yáng)市西南的一個(gè)底層滯水帶季節(jié)性缺氧人工水庫(kù)，湖水面積3.4km2，匯水面積為190km2，平均水深13.2m，最大水深24m，匯水區(qū)域分布大小煤礦200余個(gè)[9]，大量酸性礦山廢水長(zhǎng)期入湖，且該水庫(kù)為各處水流交匯區(qū)域，具有煤礦廢水和生活污水復(fù)合污染的綜合特征.紅楓湖、百花湖地處貴州中部烏江主要支流貓?zhí)拥纳?、中游，是典型的深水分層人工水?kù).紅楓湖最大庫(kù)容6.01×108m3，湖水平均深度為10.25m，最大深度為45m.百花湖是紅楓湖的下一級(jí)水庫(kù)，以紅楓湖的下泄水為主要補(bǔ)給，流域面積1895km2，蓄水面積1415km2，最大庫(kù)容1.91×108m3，湖水平均深度為12.55m，最大深度為45m.近年來，工業(yè)污水與生活污水的排入，使得紅楓湖和百花湖富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重[10].

1.2 樣品的采集

1) 采樣點(diǎn)的選擇：選擇貴陽(yáng)市“兩湖一庫(kù)”作為采樣點(diǎn)，分別是阿哈水庫(kù)大壩(26°32′36″N，106°39′2″E；H=1094.37m)、阿哈水庫(kù)長(zhǎng)灘(26°32′9″N，106°38′39″E；H=1108.07m)、百花湖碼頭(26°39′57″N，106°32′2″E；H=1204.17m)、紅楓湖大壩(26°32′27″N，106°25′36″E；H=1235.68m).其具體分布見圖1.

2) 沉積物的采集：利用SWB-1型便攜式不擾動(dòng)湖泊沉積物采樣器分別于2012年2、6、9月在貴陽(yáng)市“兩湖一庫(kù)”選擇1～2個(gè)完整水-沉積物剖面采集沉積物柱[11].所采集的沉積物界面水清澈，沉積物保存完好未受明顯擾動(dòng).

3) 樣品的分割：測(cè)量硫酸鹽還原菌(sulfate reducing bacteria， SRB)的沉積物柱子密封保存帶回實(shí)驗(yàn)室在保持充氮條件下進(jìn)行分割(前10cm按2cm間距進(jìn)行分割，10cm后按3cm間距分割).測(cè)定硫酸根的柱子在厭氧袋充氮條件下前10cm按1cm分割，10cm后按2cm分割，離心后在厭氧袋中用0.45μm濾膜(Millipore)過濾提取間隙水測(cè)量其硫酸根含量.相應(yīng)的沉積物冷凍烘干，磨細(xì)過篩后測(cè)其有機(jī)質(zhì)含量及pH.

圖1 研究區(qū)采樣點(diǎn)分布Fig.1 Location of the sampling sites in the study area

1.3 樣品的測(cè)定

1) 硫酸鹽還原菌的測(cè)定：充氮條件下稱取10g沉積物于無菌無氧、裝有100ml無菌無氧水的厭氧三角瓶中，在搖床上振蕩20min，用1ml無菌注射器取1ml上清液于KBC-SRB試劑瓶(北京華運(yùn)安特科技有限責(zé)任公司)中進(jìn)行梯度稀釋，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，6個(gè)梯度.將注射好的試劑瓶放入35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d.根據(jù)測(cè)試瓶的陽(yáng)性反應(yīng)(出現(xiàn)黑色沉淀或者鐵釘變黑)數(shù)查MPN計(jì)數(shù)表確定其MPN數(shù)[12]，再計(jì)算其實(shí)際含量(按沉積物濕重計(jì)).

2) 硫酸根的測(cè)定：采用離子色譜直接上機(jī)測(cè)定[13].

3) 有機(jī)質(zhì)的測(cè)定：重鉻酸鉀氧化-外加熱法測(cè)定(GB/T 7857-1987).

4) pH、溫度(T)、溶解氧(DO)：便攜式水質(zhì)參數(shù)儀測(cè)定.

2 結(jié)果與討論

2.1 沉積物中硫酸鹽還原菌分布特征

“兩湖一庫(kù)”不同季節(jié)SRB含量分布表明，阿哈水庫(kù)2012年2月份SRB含量范圍在0.095×104～0.45×104cells/g之間，SRB含量峰值主要集中在沉積物中部7～17cm范圍內(nèi)(圖2).阿哈水庫(kù)6、9月SRB含量范圍分別在0.95×104～45×104cells/g與0.45×104～45×104cells/g之間，比冬季高出2個(gè)數(shù)量級(jí)，SRB含量峰值主要集中在沉積物中上部.紅楓湖6、9月SRB含量范圍分別在0.95×104～25×104cells/g與0.95×104～9.5×104cells/g之間，SRB含量峰值主要集中在沉積物中部，其最大含量在表層，這與汪福順的結(jié)果有較大差異[2]，但與王明義等的結(jié)果接近[9].而百花湖SRB含量范圍在0.95×104～25×104cells/g之間，SRB含量峰值主要集中在沉積物中上部1～9cm處.百花湖、紅楓湖夏、秋季節(jié)SRB含量和阿哈水庫(kù)沉積物SRB含量基本處于同一數(shù)量級(jí)范圍，但從整個(gè)剖面分布看，沉積物表層5cm SRB含量明顯低于阿哈水庫(kù).陳皓文研究表明[14]海洋沉積物中SRB含量可達(dá)107cells/g，淡水湖泊沉積物SRB含量較海洋沉積物低，通常認(rèn)為海洋沉積物由于有較高濃度的硫酸鹽，使得SRB含量高于湖泊沉積物.

圖2 “兩湖一庫(kù)”不同季節(jié)SRB含量Fig.2 SRB distributions in the sediment of Aha Reservoir， Lake Hongfeng and Lake Baihua

2.2 溫度、DO對(duì)SRB的影響

由于沉積物中DO、T不易檢測(cè)，所以用湖泊界面水的DO、T示意沉積物表層的DO、T(表1).王建軍等[15]的研究結(jié)果表明，湖泊的氧氣侵蝕深度(Oxygen Penetration Depth， OPD)均值為5.34mm，變化范圍在3.92～7.60mm之間，說明湖水DO對(duì)沉積物表層的影響很大.

阿哈水庫(kù)長(zhǎng)灘2月份界面水溫度為7.2℃；6、9月份界面水溫度分別為12.9、17.5℃(表1).由此可以看出，6、9月份界面水溫度分別高出2月份約6～10℃；紅楓湖和百花湖也表現(xiàn)出了同樣的變化規(guī)律.有文獻(xiàn)顯示，溫度將影響SRB的代謝活性和生長(zhǎng)速度，至今所分離到的SRB為中溫性[16].這就很好地解釋了6、9月份整個(gè)沉積物剖面SRB含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2月份的原因.同時(shí)也表明，溫度是限制SRB生長(zhǎng)的重要因素.

SRB是嚴(yán)格厭氧菌，并發(fā)現(xiàn)其中有些菌種在無硫酸鹽存在時(shí)仍能通過發(fā)酵獲得能量而生長(zhǎng)，但是所有的SRB都不能以氧作為電子受體，一般來說，氧嚴(yán)重地抑制其生長(zhǎng)[17].湖泊中2月份界面水DO含量在6～7mg/L，而在6、9月份界面水DO僅有1mg/L(表1).張小里等[18]的研究結(jié)果表明，雖然SRB具有一定的耐氧性，但是當(dāng)水體中DO濃度在5mg/L時(shí)，其SRB含量?jī)H有100cells/ml，而DO濃度為0.2～3.0mg/L時(shí)，SRB含量大于103cells/ml.夏、秋季表層沉積物SRB含量高于冬季500～1000倍左右；而在中、下部沉積物中，夏、秋季SRB含量?jī)H高于冬季10～100左右(圖2).由此可以看出，DO含量的季節(jié)變化嚴(yán)重影響表層沉積物中SRB的生長(zhǎng).因此，對(duì)于表層沉積物，DO與溫度同時(shí)影響其SRB的生長(zhǎng)；而對(duì)于中、下部沉積物，SRB含量主要受到溫度變量的影響，這也是表層沉積物的季節(jié)分布差異大于中下部沉積物的一個(gè)原因.

表1 “兩湖一庫(kù)”界面水溶解氧濃度與溫度

Tab.1 Dissolved oxygen concentration and temperature of interfacial water in Aha Reservoir， Lake Hongfeng and Lake Baihua

采樣點(diǎn)時(shí)間DO/(mg/L)T/℃阿哈水庫(kù)長(zhǎng)灘2012年2月7.717.22012年6月0.0512.92012年9月0.9017.5阿哈水庫(kù)大壩2012年2月6.157.32012年6月1.0911.92012年9月1.5012.3百花湖2012年6月3.4714.02012年9月1.1015.5紅楓湖2012年6月0.9310.82012年9月0.8022.9

2.3 pH、有機(jī)質(zhì)對(duì)SRB的影響

“兩湖一庫(kù)”沉積物的pH范圍在6.22～7.10，基本在7.00左右(圖3a).有文獻(xiàn)表明[19]，當(dāng)pH在6.0～8.0之間時(shí)，硫酸鹽還原效果最好，反應(yīng)器中的pH范圍為6.0～8.0時(shí)，反應(yīng)器中的硫酸鹽還原是可行的.由此可見，“兩湖一庫(kù)”沉積物的pH滿足硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)范圍.

SRB屬于異養(yǎng)微生物，即其生長(zhǎng)代謝轉(zhuǎn)化硫酸鹽需要一定的碳源，這些碳源既是增加生物量所需，又作為電子供體對(duì)硫酸鹽進(jìn)行還原異化[16].“兩湖一庫(kù)”沉積物有機(jī)質(zhì)分布表明，百花湖沉積物有機(jī)質(zhì)含量范圍為8.08%～13.04%，平均為11.59%；紅楓湖有機(jī)質(zhì)含量范圍為8.94%～11.99%，平均為9.79%(圖3b)；大于王春雨等[20]的測(cè)量結(jié)果(百花湖3%～7%、紅楓湖2%～9%)，這主要是由于近年來百花湖、紅楓湖富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重，水質(zhì)受到嚴(yán)重污染[21].同時(shí)，阿哈水庫(kù)大壩與阿哈水庫(kù)長(zhǎng)灘有機(jī)質(zhì)平均含量為8.05%和8.30%，這可能是由于阿哈水庫(kù)匯水區(qū)域內(nèi)200余個(gè)大小煤礦使得阿哈水庫(kù)大面積受到工業(yè)廢水污染，導(dǎo)致有機(jī)質(zhì)含量豐富.由此可以看出，“兩湖一庫(kù)”都屬于有機(jī)質(zhì)非常豐富的沉積物，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同一流域的東風(fēng)水庫(kù)(2.20%～4.88%)[22]等，因此，“兩湖一庫(kù)”豐富的有機(jī)質(zhì)為硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)提供了很好的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).

圖3 “兩湖一庫(kù)”沉積物pH(a)與有機(jī)質(zhì)含量(b)分布Fig.3 pH(a) and organic matter content(b) distributions in the sediment of Aha Reservoir， Lake Hongfeng and Lake Baihua

2.4 硫酸根對(duì)SRB的影響

SRB通常指的是能通過異化作用進(jìn)行硫酸鹽還原的一類細(xì)菌.湖泊沉積物中硫酸根離子含量在所有季節(jié)都呈從上層到下層逐漸減少的趨勢(shì)，在表層達(dá)到最大，隨著深度增加硫酸根含量開始下降.在阿哈水庫(kù)，2月份沉積物中硫酸根含量達(dá)到所有季節(jié)中的最大值，表層達(dá)到288mg/L左右，6月份表層孔隙水硫酸根含量在30mg/L左右；在紅楓湖9月份沉積物中硫酸根含量在3mg/L左右，6月份大約為10mg/L；百花湖6、9月硫酸根含量分別為15mg/L與10mg/L左右.因此，百花湖與紅楓湖沉積物孔隙水硫酸根含量明顯低于阿哈水庫(kù)，表明阿哈水庫(kù)長(zhǎng)期受煤礦酸性廢水影響，其硫酸根含量異常(圖4).

百花湖、紅楓湖上部(沉積物1～5cm)硫酸鹽還原菌含量低于阿哈水庫(kù)一個(gè)數(shù)量級(jí)，這可能是硫酸根含量差異導(dǎo)致的結(jié)果(圖2).但在中下部，SRB含量只是稍低，基本處于同一個(gè)水平.表明當(dāng)硫酸根達(dá)到一定量時(shí)，就不再限制SRB的生長(zhǎng)；有機(jī)質(zhì)作為SRB異養(yǎng)生長(zhǎng)的重要食物，在貴陽(yáng)市“兩湖一庫(kù)”中含量充足，是導(dǎo)致SRB含量差異變小的重要原因.

圖4 “兩湖一庫(kù)”沉積物含量季節(jié)分布Fig.4 Seasonal distributions of sulfate content in the sediment of Aha Reservoir， Lake Hongfeng and Lake Baihua

3 結(jié)論

本文分別采用MPN計(jì)數(shù)法與離子色譜法測(cè)定了貴陽(yáng)市“兩湖一庫(kù)”沉積物中硫酸鹽還原菌與硫酸根的含量，并同時(shí)測(cè)定了其有機(jī)質(zhì)含量及相應(yīng)的水質(zhì)參數(shù).主要結(jié)論如下：

1) 硫酸鹽還原菌受溫度、DO的影響極大，在2月份，所有湖泊中硫酸鹽還原菌含量極低，僅約0.095×104cells/g，而在6、9月份，其硫酸鹽還原菌含量在10×104cells/g左右，高出2月份3個(gè)數(shù)量級(jí).同時(shí)，受溶解氧的影響，夏、秋季節(jié)表層沉積物SRB含量高于冬季500～1000倍左右；而在中下部，夏、秋季節(jié)SRB含量?jī)H高于冬季10～100左右，說明溶解氧含量的季節(jié)變化嚴(yán)重影響表層沉積物中SRB的生長(zhǎng).

2) 在溫度、有機(jī)質(zhì)等適宜的條件下，夏、秋季硫酸根含量在一定程度上影響硫酸鹽還原菌的分布，阿哈水庫(kù)由于礦山廢水污染使得其硫酸根含量高于紅楓湖和百花湖，但是SRB含量差異主要表現(xiàn)在夏、秋季節(jié)的上部沉積物，在中下部沉積物中沒有明顯差異.

3) 總體來看，“兩湖一庫(kù)”豐富的有機(jī)質(zhì)、適宜的pH等為硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)提供了良好的環(huán)境，從而使得同一季節(jié)湖泊中SRB含量差異較小.

[1] 張 維.紅楓湖、百花湖環(huán)境特征及富營(yíng)養(yǎng)化.貴陽(yáng)：貴州科技出版社，1999：20-21.

[2] 汪福順，劉叢強(qiáng)，梁小兵等.阿哈水庫(kù)沉積物-水界面硫酸鹽還原菌作用的微生物及其同位素研究.第四紀(jì)研究，2003，23(5)：20.

[3] 胡德容，林 欽.硫酸鹽還原菌(SRB)生態(tài)特性及其研究進(jìn)展.南方水產(chǎn)，2007，3(3)：67-72.

[4] Rudd JWM， Kelly CA， Schinder DWA. Comparison of the acidification efficiencies of by two whole-lake addition experiments.LimnologyandOceanography， 1990，35(5)： 663-679.

[5] Kuhl M， Jsrgensen BB. Microscensor measurements of sulfate reduction and sulfide oxidstion in compact microbial communities of acrobic biofilm.ApplEnvironMicrobiol， 1992，58： 1164-1174.

[6] Edwards EA， Wills LE， Reinhard Metal. Anaerobic degradation of toluene and xylene by aquifer microorganisms under sulfate-reducing conditions.ApplEnvironMicrobiol， 1992，58： 794-800.

[7] King JK， Kostka JE， Frischer MEetal. Sulfate-reduction bacteria methylate mercury at varible rates in pure culture and in marine sediments.ApplEnvironMicrobiol， 2000，66： 2430-2437.

[8] Lovley DR， Phillips EJP. Reduction of uranium by Desulfovibrio desulfuricans.ApplEnvironMicrobiol， 1992，58： 850-856.

[9] 王明義，張 偉，梁小兵等.阿哈水庫(kù)與洱海沉積物硫酸鹽還原菌研究.水資源保護(hù)，2007，23(3)：9-19.

[10] 呂迎春，劉叢強(qiáng)，王仕祿等.貴州喀斯特水庫(kù)紅楓湖、百花湖p(CO2)季節(jié)變化研究.環(huán)境科學(xué)，2007，28(12)：2764-2781.

[11] 王春雨，黃榮貴，萬(wàn)國(guó)江.SWB-1型便攜式沉積物-界面水取樣器的研制.地質(zhì)地球化學(xué)，1998，(1)：91-96.

[12] 吳 浩.中國(guó)主要紅樹林濕地中甲基汞的分布規(guī)律及其微生物甲基化作用[學(xué)位論文].廈門：廈門大學(xué)，2009.

[13] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》編委會(huì).水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法：第4版.北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，2002.

[14] 陳皓文.海洋硫酸鹽還原菌及其活動(dòng)的經(jīng)濟(jì)重要性.黃渤海海洋，1998，16(4)：64-74.

[15] 王建軍，沈 吉，張 路等.湖泊沉積物-水界面氧氣交換速率的測(cè)定及影響因素.湖泊科學(xué)，2009，21(4)：474-482.

[16] 梁 宇.硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)因子的探討.山西建筑，2012，36(30)：199-200.

[17] 趙宇華，葉央芳，劉學(xué)東.硫酸鹽還原菌及其影響因子.環(huán)境污染與舫治，1997，19(5)：41-43.

[18] 張小里，陳志昕，劉海洪等.環(huán)境因素對(duì)硫酸鹽還原菌生長(zhǎng)的影響.中國(guó)腐蝕與防護(hù)學(xué)報(bào)，2000，20(4)：224-228.

[19] Renze T， Van Houten， Letting G．A novel reactor design for biological sulphate removal． Proc．8， International Conf．on Anaerobic Design， 1997： 25-29．

[20] 王雨春，萬(wàn)國(guó)江，王仕祿等.紅楓湖、百花湖沉積物中磷的存在形態(tài)研究.礦物學(xué)報(bào)，2000，20(3)：273-277.

[21] 李 旗.紅楓湖、百花湖今年來富營(yíng)養(yǎng)化狀況分析.貴州工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，30(5)：98-101.

[22] 潘魯生.烏江流域東風(fēng)水庫(kù)水體/沉積物中汞形態(tài)分布及界面擴(kuò)散通量估算[學(xué)位論文].貴陽(yáng)：貴州大學(xué)，2010.