陸明海，姚玉昌，劉玉峰，王素梅，何海娟，李 武

(1.黑龍江農(nóng)墾科技職業(yè)學院，哈爾濱 150431；2.東北農(nóng)業(yè)大學，哈爾濱 150030；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院，哈爾濱 150086；4.黑龍江職業(yè)學院，哈爾濱 150080)

隨著動物基因工程、細胞工程、胚胎工程等高新生物技術(shù)日新月異的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的制備、哺乳動物體細胞克隆、基因打靶、基因敲除等高新生物技術(shù)已開始從實驗室走向廣闊的應(yīng)用市場[1]。盡管上述高新生物技術(shù)的應(yīng)用前景十分誘人，但是其主要應(yīng)用基礎(chǔ)技術(shù)之一的超數(shù)排卵技術(shù)的實際應(yīng)用效果，仍遠未達到人們的預期。影響超數(shù)排卵效果的因素非常復雜，迄今其獲卵效果還不是十分穩(wěn)定。

筆者在最近兩年進行的四次轉(zhuǎn)基因試驗，都是利用原核注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊，這種方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物是比較有效的的技術(shù)手段，但在這個過程中需要大量的原核胚胎，而超數(shù)排卵技術(shù)是供應(yīng)大量成熟優(yōu)良的原核胚的重要技術(shù)手段。本文以這四次生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊為契機，對可能影響轉(zhuǎn)基因山羊超數(shù)排卵的左右卵巢、體重、FSH劑量、超排季節(jié)等因素進行系統(tǒng)觀察、統(tǒng)計和分析，以期提高山羊超數(shù)排卵生產(chǎn)原核胚的生產(chǎn)效率，從而提高轉(zhuǎn)基因山羊的生產(chǎn)效率，為今后生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品及設(shè)備

促卵泡素(FSH)100 IU/只，促黃體素(LH)200 IU/只，孕馬血清促性腺激素(PMSG)1 000 IU/只，寧波激素廠產(chǎn)；氯前列烯醇2 mL/只，上海計劃生育所產(chǎn)；分叉陰道栓(CIDR)20個/包，沖胚液(PBS)1 000 mL/袋，Holding試劑50 mL/袋，新西蘭產(chǎn)；海綿栓(50個/包)，黑龍江省農(nóng)科院畜牧所產(chǎn)。

其它實驗藥品有酒精、碘酒、新潔爾滅、抗生素、生理鹽水、青霉素、鏈霉素。

實驗用設(shè)備及器械主要有：腹腔鏡、腹腔內(nèi)輸精槍、沖卵管、細菌濾器、撿胚針、移胚針、實體顯微鏡、恒溫臺、水浴鍋等。

1.2 胚胎的獲取

1.2.1 試驗動物選擇

選擇膘情好，無明顯繁殖疾病，具有正常發(fā)情周期的山羊作為供體，當?shù)赝练N山羊母羊作為受體。

1.2.2 供體山羊超排處理

分別在2010年的5月、7月、12月、2011年12月進行了4次超數(shù)排卵轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?。每次實驗，分別以受供體同時埋栓當天記第0天，在埋栓第14天時，在早晨6：00開始給供體羊進行超數(shù)排卵處理，每天早晚各一針，采用促卵泡素(FSH)遞減法進行，連續(xù)8針；在埋栓的第16天晚或第17天早對受體進行撤栓，同時肌注200～250 IU 孕馬血清促性腺激素(PMSG)；供體在埋栓的第17天時進行撤栓，同時肌注前列腺素(PG)0.1 mg；在最后一針FSH注射完的下一個晚上進行肌注促黃體素(LH)100 IU；于注射LH的當天下午進行腹腔內(nèi)輸精。在輸精后的第2天早8時進行手術(shù)沖胚。

1.2.3 沖胚方法

采用常規(guī)手術(shù)方法沖胚，以輸精時腹腔鏡的入口為基礎(chǔ)，以一食指的粗細為準，拉出子宮角進行沖胚，一側(cè)結(jié)束還納后，再拉出另一側(cè)進行沖胚。采用逆向沖胚法，從輸卵管傘部回收早期胚胎，在實體顯微鏡下將胚胎撿出，進行轉(zhuǎn)基因胚胎構(gòu)建。

1.3 實驗地點

青島森淼生物技術(shù)有限公司實驗基地。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用excel中的數(shù)據(jù)分析軟件計算進行差異顯著性分析，以p值0.05和0.01作為顯著性檢驗的標準，結(jié)果均以平均值±標準誤差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 山羊超數(shù)排卵實驗情況

本研究對近幾年所做的山羊超數(shù)排卵生產(chǎn)原核胚效果的影響進行了統(tǒng)計分析。詳見表1。

表1 山羊超數(shù)排卵情況

表1為在2010～2011年進行的4次超數(shù)排卵的試驗效果，總體平均獲卵數(shù)為12.8枚/只。

2.2 左右卵巢排卵差異情況

對近幾年所做的山羊超數(shù)排卵過程中左右卵巢排卵情況進行了統(tǒng)計分析，其效果如表2所示：

表2 山羊超數(shù)排卵中左右卵巢排卵數(shù)比較

注：P>0.05，兩者差異不顯著。

本實驗對于116只個體進行左右卵巢排卵數(shù)的比較。統(tǒng)計結(jié)果表明，山羊左右兩側(cè)在排卵數(shù)上沒有差異，兩卵巢排卵數(shù)是相同的。所以，在沖胚時兩側(cè)沖胚要同樣重視。

2.3 FSH劑量對山羊超數(shù)排卵的影響

對近幾年所做的山羊超數(shù)排卵過程中，不同F(xiàn)SH劑量對超數(shù)排卵效果的影響進行了統(tǒng)計分析。見表3。

表3 不同劑量FSH超數(shù)排卵情況比較

注：P>0.05，平均獲卵數(shù)各組間差異不顯著。

本實驗對不同劑量的超排效果進行了比較(如表3)。研究表明：在試驗羊隨機區(qū)組設(shè)計上，各組平均獲卵數(shù)和平均可用胚數(shù)差異不顯著。表明180～240 IU的FSH對山羊超排效果沒有顯著差異。黃俊成等報道[2]，同一批號的FSH劑量在其一定的劑量范圍內(nèi)變化時，對本地山羊和奶山羊的超數(shù)排卵效果影響不顯著。本研究結(jié)果與其相似。這表明，注射外源FSH可促進卵巢中卵泡的發(fā)育、成熟，但到達一定劑量后，超數(shù)排卵效果并不隨著外源FSH量的增加而增加。一般來說，藥物用量少可以降低成本，所以在今后超排方案設(shè)計中，可以適當降低山羊的超排用藥量。

2.4 山羊體重對超數(shù)排卵效果的影響

對近幾年所做的山羊超數(shù)排卵過程中，供體體重對超數(shù)排卵效果的影響進行了統(tǒng)計分析，其效果如表4所示：

表4 山羊體重對超排效果的影響

注：P>0.05，各組間平均獲卵數(shù)差異不顯著。

本研究對于體重在25～45 kg的山羊進行超排處理，以5 kg為一個梯度進行研究。研究表明：各組之間在平均獲卵數(shù)上差異不顯著。結(jié)果表明，山羊在25～45 kg體重之間進行超數(shù)排卵處理效果上沒有差異，都可以取得比較一致的結(jié)果。李太坤等報道[3]，30～50 kg山羊超排對超排結(jié)果沒有顯著影響。本文與之有類似的結(jié)果。所以在選擇山羊供體上，只要健康無病，體況良好，對于體重在一定范圍內(nèi)，可以不必過分苛求。有研究表明[3～5]，供體在激素劑量、純度等一定的條件下，體重稍小的山羊卵巢發(fā)育排卵的卵泡及未排卵的卵泡顯著較多，且在一定的體重范圍內(nèi)與體重呈正相關(guān)。本研究的結(jié)果也可見相同的趨勢。

表5 單位體重FSH劑量獲卵數(shù)比較

注：P>0.05，平均獲卵數(shù)，各組間差異不顯著。

對于不同F(xiàn)SH劑量與山羊的體重進行比值，取比值范圍5.5～7.0，以0.5為梯度進行研究。研究表明：各組之間在平均獲卵數(shù)上差異不顯著。這個指數(shù)是將超排山羊體重和超排劑量相結(jié)合，能更好地對這兩個指標進行衡量，對未來設(shè)計超排方案的劑量確定有很好的借鑒意義。在不影響結(jié)果的前提下，可以減少用FSH的量，節(jié)約超數(shù)排卵成本。

2.5 不同季節(jié)超排對排卵數(shù)的影響

對近幾年所做的山羊超數(shù)排卵過程中，超排季節(jié)對超數(shù)排卵效果的影響進行了統(tǒng)計分析。見表6。

表6 季節(jié)對山羊超排的影響

注：P>0.05，差異不顯著。

本研究對于超數(shù)排卵進行的季節(jié)進行了統(tǒng)計。結(jié)果表明：山羊在春季和冬季進行的超數(shù)排卵操作時，兩季節(jié)平均獲卵數(shù)上差異不顯著。山羊是常年發(fā)情動物，在各個季節(jié)都會發(fā)情。2001年蘇和等報道[6]，6月和12月份超排效果不好，與本研究不同。

3 結(jié)論

3.1 山羊在超數(shù)排卵時，左右卵巢排卵數(shù)差異不顯著。

3.2 山羊體重在25～50 kg之間對超排結(jié)果沒有差異。

3.3 山羊超排劑量與體重之比(IU/kg)在5.5～7.0之間效果差異不顯著，可以取得比較好的超排效果。

3.4 山羊在春季和冬季的超排效果沒有差異。

[1] 倪和民，張鴻波，劉云海，等.3個品種綿羊超數(shù)排卵處理后卵巢上促黃體素受體表達差異的研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，2011，42(11)：1625-1631.

[2] 黃俊成，史洪才，楊梅，等.山羊的超排處理及影響因素的研究[J].草食家畜.2001年(增刊)：107-109.

[3] 李太坤，李文婷，鄒恒，等.山羊體重、重復超排次數(shù)對超數(shù)排卵效果的影響[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2011，6：31-32.

[4] 張瑣林，王述宇.波爾山羊超數(shù)排卵方案的研究[J].中國草食動物，2001，4：10-14.

[5] Picazo R A，Cocero M L，Barragan，et al.Effects of LH administration at the end of an FSH superovulatory regimen on ovulation rate and embryo production in three breeds of sheep[J].Theriogenology，1996，41(1)：1065-1073.

[6] 蘇和，趙霞，達來.波爾山羊超數(shù)排卵技術(shù)的研究[J].內(nèi)蒙古畜牧科學，2001，22，(3)：36-37.