潘坤 張澤明 趙學(xué)琴 馮欣

·論著·

低氧誘導(dǎo)因子1-α的表達(dá)及DNA結(jié)合活性在非小細(xì)胞肺癌中的臨床意義

潘坤 張澤明 趙學(xué)琴 馮欣

目的探討非小細(xì)胞肺癌患者肺組織中HIF-1α的表達(dá)及DNA結(jié)合活性的動(dòng)態(tài)變化與腫瘤病理學(xué)特性的關(guān)系。方法收集89例非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤及癌旁正常肺組織標(biāo)本，RT-PCR檢測(cè)HIF-1α的mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)HIF-1α的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，EMSA法檢測(cè)HIF-1α DNA結(jié)合活性的表達(dá)變化，并結(jié)合臨床及病理特征進(jìn)行分析。結(jié)果HIF-1α mRNA及蛋白的表達(dá)水平在腫瘤組織中均明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。HIF-1α的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌病理分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤組HIF-1α 的DNA結(jié)合活性較癌旁正常組織增高，2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。結(jié)論HIF-1α的高表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)與非小細(xì)胞肺癌發(fā)病密切相關(guān)，可將此作為抑制腫瘤發(fā)病的靶點(diǎn)。

非小細(xì)胞肺癌;低氧誘導(dǎo)因子-1α；DNA結(jié)合活性

肺癌是惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快的，其中67%左右為非小細(xì)胞肺癌(non-smαll-cell lung cαncer， NSCLC)，其惡性度高，轉(zhuǎn)移早，嚴(yán)重危害人類健康。經(jīng)研究證實(shí)，惡性腫瘤發(fā)生的一個(gè)典型特點(diǎn)是細(xì)胞的過度增殖及血管生成，而細(xì)胞增殖會(huì)消耗大量氧氣，所以實(shí)體腫瘤微環(huán)境的基本特征之一是低氧。目前已證實(shí)低氧誘導(dǎo)因子1-α (hypoxiα inducible fαctor 1 αlph， HIF-1α) 大量表達(dá)于人體多種腫瘤中，參與了腫瘤的生長(zhǎng)繁殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血管生成、細(xì)胞凋亡等[1,2]，因此，HIF-1α 的表達(dá)可能是腫瘤進(jìn)展過程中的早期信號(hào)，其表達(dá)變化可能在一定程度上能反應(yīng)疾病的進(jìn)展及分期。HIF-1α可以調(diào)節(jié)多種靶基因參與腫瘤的生成，其與靶基因結(jié)合活性的變化可能也參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過程。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)89例非小細(xì)胞肺癌患者及癌旁正常對(duì)照肺組織中的HIF-1α表達(dá)水平及DNA結(jié)合活性的變化，分析HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌患者中與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等生物學(xué)特性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取我院2010年7月至2012年4月經(jīng)手術(shù)切除的并經(jīng)病理確診的非小細(xì)胞肺癌患者為研究對(duì)象，收集89例患者肺癌組織、癌旁正常肺組織(距離腫瘤邊緣>5 cm以上)標(biāo)本進(jìn)行試驗(yàn)。所選患者術(shù)前均未行化療、放療、介入及中醫(yī)中藥等抗腫瘤治療，有完整的病例資料。其中男54例，女35例；年齡37～64歲，平均年齡58歲。其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組51例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組38例；TNM：Ⅰ期26例，Ⅱ期34例，Ⅲ期29例。臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：按照第七版美國(guó)聯(lián)合癌癥分類委員會(huì)(AJCC)和國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)制訂的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分類。Western blot檢測(cè)所用的腫瘤肺組織及癌旁正常肺組織切除后立即置于-70℃冰凍保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 RT-PCR：使用由上海生物工程公司合成的擴(kuò)增引物，嚴(yán)格按照該公司TRIZOL試劑使用說明書進(jìn)行試驗(yàn)，提取總RNΑ，逆轉(zhuǎn)錄之后行PCR，得到RT-PCR產(chǎn)物后應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶行吸光度半定量分析。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，32循環(huán)后72℃延伸10 min。檢測(cè)基因HIF-1α和內(nèi)參照物β-αctin的引物序列分別為：HIF-1α (433 bp)上游：5’-GCCCCTΑCTΑTGTCGCTTTC-3’，下游：5’-GGCCCΑΑΑCTΑΑΑCTΑTCTGΑ-3’；β-αctin(635bp)上游：5’-CCTΑΑGGCCΑΑCCGTGΑΑ-3’，下游：5’-CTΑGGΑGCCΑGGGCΑGTΑΑTC-3’。

Western blot：0.1 g肺組織剪碎加入RIPΑ 裂解液，冰浴勻漿，4℃ 10 000 g離心，將沉淀去除后得到肺組織總蛋白，將蛋白樣本稀釋成相等濃度分裝，置于- 80℃冰凍保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)使用微量進(jìn)樣器將等量蛋白質(zhì)樣本加至7.5%SDS-丙烯酰胺凝膠孔中，采用200 V電壓電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)過夜孵育，TBST緩沖液漂洗后加入二抗(1∶2 000)室溫雜交1 h，充分漂洗后化學(xué)發(fā)光試劑盒膠片曝光，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶吸光度行半定量分析。

電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)：應(yīng)用Lighshift化學(xué)發(fā)光EMSA試劑盒、核蛋白和胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒進(jìn)行操作(均購(gòu)自Pierce公司)，參照說明書進(jìn)行試驗(yàn)，雙鏈寡核苷酸片段如下( 5’-AGCTTGCCCTACGTGCTGTCTCAG-3’)[3]，應(yīng)用生物素進(jìn)行標(biāo)記，能夠與HIF-1α特異性結(jié)合。試驗(yàn)中設(shè)空白對(duì)照組及特異性競(jìng)爭(zhēng)組，空白對(duì)照組為反應(yīng)體系中不加細(xì)胞核提取物，特異性競(jìng)爭(zhēng)組為加入100倍濃度的未標(biāo)記的HIF-1α一致性雙鏈寡核苷酸序列。

1.3 結(jié)果評(píng)定 應(yīng)用上海Tαnon Gis-2010圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western blot、RT-PCR產(chǎn)物條帶行半定量分析，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參照β-αctin的吸光度比值，同時(shí)對(duì)EMSA活性結(jié)果行光密度分析，計(jì)算半定量值。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α mRNA及蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及二者與肺癌病理特征的關(guān)系 RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，HIF-1α的mRNA和蛋白含量在NSCLC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常肺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)HIF-1α的表達(dá)在腫瘤不同分期間差異亦有顯著性，隨疾病臨床分期進(jìn)展表達(dá)呈遞增趨勢(shì)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HIF-1α的mRNA和蛋白含量表達(dá)均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 對(duì)照組及不同病理分期各組間HIF-1α mRNA和蛋白比較

表1 對(duì)照組及不同病理分期各組間HIF-1α mRNA和蛋白比較

組別HIF-1αmRNAHIF-1α蛋白癌旁正常對(duì)照組(n=89)6.5±1.29.2±1.8NSCLCⅠ期(n=26)11.2±1.9*15.1±2.7*NSCLCⅡ期(n=3415.8±2.8*#18.8±3.5*#NSCLCⅢ期(n=29)21.2±3.5*#☆25.5±4.9*#☆ F值395.386249.693 P值0.0000.000

注：與正常組比較，*P<0.05；與Ⅰ期比較，#P<0.05；與Ⅱ期比較，☆P<0.05

表2 對(duì)照組及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間HIF-1α mRNA和蛋白比較

表2 對(duì)照組及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間HIF-1α mRNA和蛋白比較

組別HIF-1αmRNAHIF-1α蛋白癌旁正常對(duì)照組(n=89)6.5±1.29.2±1.8無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(n=38)13.6±2.1*16.4±3.1*有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(n=51)18.7±3.9*#20.9±4.2*#F值419.544270.003P值0.0000.000

注：與正常組比較，*P<0.05；與無轉(zhuǎn)移組比較，#P<0.05

2.2 HIF-1α的DNA結(jié)合活性在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá) EMSA試驗(yàn)中，空白對(duì)照組、特異性競(jìng)爭(zhēng)組、癌旁組織及腫瘤組織組各樣本圖像結(jié)果顯示(圖1)，空白對(duì)照組僅有自由帶，無結(jié)合帶，特異性競(jìng)爭(zhēng)組中亦無結(jié)合帶，提示探針與HIF-1α的結(jié)合是特異性的。在癌旁組織及腫瘤組織中，圖像顯示出了深淺不一的DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合帶。癌旁組織HIF-1α的DNA結(jié)合活性水平較低，腫瘤組織HIF-1α的DNA結(jié)合活性迅速升高，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義，但q檢驗(yàn)提示，HIF-1α的DNA結(jié)合活性與病理分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。

3 討論

在全球范圍內(nèi)肺部腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的主要惡性腫瘤，按病理類型分類以非小細(xì)胞肺癌為主，由于非小細(xì)胞肺癌患者在早期并無典型癥狀，約為三分之二的患者確診時(shí)已處于疾病晚期，同時(shí)失去了最佳治療時(shí)機(jī)。目前在我國(guó)非小細(xì)胞肺癌的治療仍以傳統(tǒng)的手術(shù)治療、全身或局部化療、放療為主，但非小細(xì)胞肺癌Ⅰ期患者即使是經(jīng)手術(shù)完全切除的，術(shù)后2年的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移率也超過40%。因此，探討新的非小細(xì)胞肺癌治療方法已成為當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。

圖1 EMSA檢測(cè)HIF-1α的DNA結(jié)合活性

低氧誘導(dǎo)因子-l (hypoxiα inducible fαctor 1， HIF-1)是異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由α和β兩個(gè)亞基組成，α亞基是功能亞基，被稱為氧感受器。HIF-1α能調(diào)節(jié)參與糖酵解、紅細(xì)胞增生、細(xì)胞增殖、血管生成等共100多種低氧適應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄水平[4]，因此，其結(jié)合活性及蛋白含量的變化均可引起相應(yīng)目標(biāo)基因的表達(dá)變化進(jìn)而導(dǎo)致相應(yīng)疾病，它可誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄激活，在調(diào)節(jié)腫瘤血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥等方面發(fā)揮重要作用[5]。大部分學(xué)者經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與病理類型、分化程度等無關(guān)[6-8]，另有學(xué)者則持相反意見，認(rèn)為HIF-1α的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)[9]。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)此因子的研究多應(yīng)用免疫組化及原位雜交等試驗(yàn)方法，定量研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過RT-PC、Western blot來研究非小細(xì)胞肺癌患者中HIF-1α的表達(dá)水平，同時(shí)應(yīng)用EMSA研究HIF-1α DNA結(jié)合活性的變化，探討其與腫瘤臨床生物學(xué)特性的關(guān)系

本試驗(yàn)通過各腫瘤組與對(duì)照組的數(shù)據(jù)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組癌旁正常肺組織中，HIF-1α蛋白及DNA結(jié)合活性均有一定表達(dá)，提示在正常肺組織中HIF-1α對(duì)其下游目標(biāo)基因的調(diào)節(jié)作用也是存在的。非小細(xì)胞肺癌患者Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期腫瘤組織的HIF-1α的mRNA和蛋白含量均呈遞增趨勢(shì)，各組與對(duì)照組比較差異均有顯著性意義，同時(shí)腫瘤組各組間HIF-1α的mRNA和蛋白含量比較差異亦有顯著性，提示HIF-1α量的表達(dá)變化在一定程度上可反應(yīng)疾病的進(jìn)展程度。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，HIF-1α亦表現(xiàn)出了高表達(dá)趨勢(shì)，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較差異有顯著性意義，提示HIF-1α在一定程度上可反應(yīng)疾病的預(yù)后。Hung等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可通過上調(diào)靶基因TWIST1和Snail表達(dá)水平在非小細(xì)胞肺癌的增殖、侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，TWIST1和Snail的高表達(dá)導(dǎo)致了肺癌患者更短的生存期及更快的復(fù)發(fā)。Karetsi等[11]發(fā)現(xiàn)HIF-1α可上調(diào)目標(biāo)基因VEGF的表達(dá)在腫瘤血管生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。同時(shí)亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在人肺腺癌細(xì)胞株中HIF-1α可通過上調(diào)抗凋亡基因Survivin的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡[12]，在惡性腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮作用。另有研究表明， HIF-1α可促使腫瘤組織血管發(fā)生，增加腫瘤遠(yuǎn)處侵襲、加速轉(zhuǎn)移，降低腫瘤對(duì)放、化療的敏感性[13]。上述結(jié)果均提示，HIF-1α可能在非小細(xì)胞癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，其表達(dá)水平的變化在一定程度上可反應(yīng)疾病的進(jìn)展程度及預(yù)后。

HIF-1α通過與目標(biāo)基因特定序列DNA結(jié)合進(jìn)而調(diào)控它們的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)[14]，因此，HIF-1α與目標(biāo)基因DNA結(jié)合能力的大小在一定程度上可決定其對(duì)靶基因的調(diào)控能力。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腫瘤組HIF-1α的DNA結(jié)合活性較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，提示在腫瘤組織中不僅增加的蛋白含量在腫瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮了一定作用，增強(qiáng)的DNA結(jié)合活性亦增強(qiáng)了對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄作用。HIF-1α的DNA結(jié)合活性在腫瘤各組間未發(fā)現(xiàn)有表達(dá)差異，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間亦未發(fā)現(xiàn)顯著性意義，提示HIF-1α可能在腫瘤組織中通過增強(qiáng)對(duì)靶基因的調(diào)控進(jìn)而促進(jìn)惡性腫瘤新生血管形成、加速腫瘤浸潤(rùn)，但其與靶基因的DNA結(jié)合能力不能反應(yīng)疾病的進(jìn)展程度及預(yù)后。在臨床應(yīng)用中，可考慮通過分子水平抑制HIF-1α與靶基因DNA序列結(jié)合，進(jìn)而在抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

綜上所述，HIF-1α在肺部腫瘤細(xì)胞的表達(dá)增加表現(xiàn)在多個(gè)方面，包括基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平，同時(shí)其與靶基因的結(jié)合活性亦呈增高趨勢(shì)，上述各因素共同作用增加了對(duì)腫瘤細(xì)胞的供血、供氧及能量，使癌細(xì)胞得以迅速增殖和浸潤(rùn)。因此，研究如何降低HIF-1α的表達(dá)及DNA結(jié)合能力對(duì)于非小細(xì)胞癌的治療及改善預(yù)后具有重要的臨床意義。

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The clinical significance of expression and DNA binding activity of hypoxia-inducible factor 1-α in non-small cell lung cancer

PANKun,ZHANGZeming,ZHAOXueqin,etal.DepartmentofRespiratoryMedicine,AffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Hebei,Baoding071000,China

ObjectiveTo observe the dynamic changes of expression and DNA binding activity of hypoxia-inducible factor 1-α in non-small cell lung cancer (NSCLC),and to investigate the correlation between the changes and tumor pathological characteristics.MethodsEighty-nine cases of NSCLC tissues and adjacent normal lung tissue specimens were collected,RT-PCR was used to detect the expression levels of HIF-1α mRNA,and Western Blot was used to determine the expression levels of HIF-1α protein.EMSA assay was used to examine DNA binding activity of HIF-1α.The correlation between the expression levels and the clinical pathological features of tumors was analyzed.ResultsThe expression levels of HIF-1α mRNA and protein in tumor tissues were significantly higher than those in adjacent tissues (P<0.05).Their expression levels were correlated with tumor staging and lymph node metastasis (P<0.05).HIF-1α DNA binding activity was significantly increased,as compared with that in adjacent normal tissue (P<0.05).ConclusionThe overexpression of HIF-1αand enhancement of transcription activity are closely correlated to pathogenesis of NSCLC,which can be regarded as a target in inhibiting pathogenesis of NSCLC．

non-small cell lung cancer;hypoxia-inducible factor 1-α;DNA binding activity

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.003

071000 河北省保定市，河北大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科

R 734.2

A

1002-7386(2014)07-0972-04

2013-10-20)