熊珊珊　趙斌

摘要：通過對叢枝菌根真菌（Glomus intraradices）中分離得到的鈣調素基因序列進行分析，并利用實時熒光定量PCR（Real time PCR）研究該基因在共生體形成早期不同時間段的差異表達，以及在菌根共生體形成后，經脅迫處理，觀察鈣調素基因的表達量變化。熒光定量PCR結果表明，叢枝菌根真菌在與植物的共生過程中，存在鈣離子激增現象，表明鈣調素基因在共生早期的鈣離子信號轉導方面具有調控作用，而且在菌根真菌共生早期的菌絲生長過程中鈣調素的調控作用可能與肌球蛋白的輔助有關。

關鍵詞：叢枝菌根真菌（Glomus intraradices）；鈣調素基因；實時熒光定量PCR；菌絲生長

中圖分類號：Q938.1；Q343.3+6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）13-3177-06

The Roles of Calmodulin Gene of Glomus intraradices in Symbiosis Process

XIONG Shan-shan，ZHAO Bin

（Key laboratory of Agricultural Microbiology/College of Life Science and Technology， Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract： The differential expression of calmodulin gene obtained from Rhizophagus irregularis（Glomus intraradices） in different symbiosis stages was studied with real time PCR. The changes of calmodulin gene expression were observed by forcing treatments after the formation of mycorrhizal symbionts. The results showed that calmodulin gene had surge phenomenon during the process of symbiosis between Rhizophagus irregularis and the plant. The calmodulin gene regulated signal transduction in the early symbiotic of calcium. The calmodulin gene was rapidly detected in the environment stress and triggered a series of cascade reaction related with myosin.

Key words： （Glomus intraradices）； calmodulin gene； real time PCR； hypha growth

叢枝菌根真菌（Glomus intraradices）（AMF）是球囊菌門類真菌，定居于土壤中。90%以上的陸生植物的根系可與土壤中的真菌相互作用，其中大部分會與AMF建立內共生關系[1]。植物與AMF共生通過資源的傳遞來克服生物及非生物對自身的侵害[2]。宿主植物的根段在與AMF未直接接觸的情況下就已經有了相互作用，植物的根分泌物中含有信號分子，可以誘導AMF菌絲生長及分支[3]。這些由寄主植物釋放的特異性根分泌物質與非寄生植物分泌的物質不同，包含許多宿主信號物質，包括類黃酮（Flavonoids）和獨腳金內酯（Strigolactones）[4]。

菌根真菌和植物都存在鈣離子的激增（Ca2+ oscillations）現象，它是共生雙方發(fā)生相互作用的標志。在共生早期AMF會釋放一種信號因子與植物根分泌物中的信號物質相呼應，使鈣離子濃度發(fā)生變化，從而引發(fā)一系列的級聯反應[1]。然而，最先研究證明鈣離子作為菌根信號傳遞物質的是在苜蓿植株的根毛中[1]。AMF的鈣調素（Calmodulin，CaM）會接收鈣離子的信號，從而激活下游共生基因的轉錄。但是其中的信號轉導途徑還有待研究。構巢曲霉中的CaM會沿著肌動蛋白絲聚集到菌絲頂端進行定位生長，這可能是在一種動力蛋白的幫助下完成的[5]，最近的研究報導動力蛋白中的一員肌球蛋白馬達（Myosin motor），其重鏈上的異亮氨酸-谷氨酰胺結構（IQ motif）可以與結合了鈣離子的鈣調素結合，而菌根真菌中也發(fā)現存在動力蛋白typeⅠmyosin，它可能也參與了菌絲定位生長中CaM的調控作用[6]。

在污染的土壤中也有菌根存在，目前的研究認為接種AMF后可促進植物的生長，提高植株的生物量，對植株體內的有害物質起到稀釋作用，從而緩解其毒害作用[7]。但是AMF是如何提高植物對有害物質的耐受性，以及是否會對宿主體內的代謝途徑產生影響，而且Ca2+和H+同為轉導化學信號和環(huán)境信號的指示物質[4]，其分子機制目前尚不清楚。

本試驗旨在探討叢枝菌根真菌中鈣調素基因參與了共生早期的表達調控，研究其在共生早期鈣離子信號途徑中的作用，對進一步研究共生早期信號轉導提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

叢枝菌根真菌的分離株為BEG141，新的物種名是Rhizophagus irregularis。

DNA和 RNA的提?。喝恿考s為0.1 g，休眠孢子RNA的抽提材料為保藏于4 ℃的AMF接種劑，將接種劑利用傾斜濕篩法過180目篩后，在體式顯微鏡下挑取約2 000個孢子用于抽提DNA和RNA。供試菌株宿主為紫花苜蓿（Medicago sativa）。

根樣的收獲：取盆栽植物根段清洗干凈后，剪成0.5～1.0 cm長的小段，混勻，迅速置于液氮中。該過程盡可能短（約2 min內完成），處理后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 基因序列獲取

抽提AMF基因組DNA[8]，根據已知的CaM部分片段[9]經反向PCR克隆獲取5′端序列，RNA抽提后反轉錄，得到基因3′端序列的3′RACE克隆[10]。根據所發(fā)表的Glomus mosseae（G.m）中的Gm228[9] （它表達的馬達蛋白為type I myosin）序列設計簡并引物，獲得片段序列，再進行TA克隆及測序分析[11]。

1.3 生物信息學分析

利用Prot Param tool（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）進行鈣調素蛋白的理化性質分析，推測AMF中的CaM氨基酸序列。利用NCBI的蛋白質序列數據庫（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列的同源性比對，找到其中已正式發(fā)表的具有代表性物種的CaM序列。

1.4 共生前期試驗材料的獲取

用于抽提RNA的不同生長階段AMF材料的獲取：休眠期孢子，取 4 ℃保存的接種劑，利用濕篩法篩選干凈的休眠孢子；萌發(fā)的孢子，挑取表面滅菌[12]后的孢子置于含根分泌物[12]的滅菌水中，暗培養(yǎng)3～5 d，待孢子萌發(fā)管長度達到3～5 mm時收獲，同時以不含根分泌物為負對照；盆栽試驗，用AMF孢子侵染紫花苜蓿，根據AMF的侵染狀況收獲不同共生時期AMF侵染的根段，分為附著胞形成時期、根內菌絲生長期、叢枝形成期和泡囊期。

1.5 脅迫試驗

將接種的苜蓿進行不同脅迫處理。重金屬脅迫：以鋅（ZnSO4）和鎘（CdCl2）進行處理；鹽脅迫：以NaCl溶液及類金屬砷（Na3AsO4）對盆栽植物進行處理。

ZnSO4處理：濃度為100、200 mg/kg（以土壤中的Zn含量計算）。從植株長出第一片真葉開始，分3 d 3次澆ZnSO4溶液，植株在含鋅環(huán)境下生長4周為長期處理，短期處理則是3周后檢測AMF侵染率≥80%后，澆入200 mg/kg的ZnSO4溶液，在第0.5、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0、168.0 h取樣，共7次，3次重復。對照（CK）為種植3周后澆同樣水量的蒸餾水，0.5 h取樣的植株。

NaCl處理：濃度為0.8、1.2 g/kg（以NaCl在土壤中的含量計算），長期處理使用0.8 g/kg濃度處理，短期處理使用1.2 g/kg的脅迫濃度處理，方法與Zn脅迫相同。

CdCl2處理：60 mg/kg CdCl2進行4周的長期處理，90 mg/kg CdCl2進行短期處理，處理方法與ZnSO4脅迫相同。

Na3AsO4處理：60 mg/kg Na3AsO4進行4周的長期處理，120 mg/kg Na3AsO4進行短期處理，處理方法與Zn相同。

除此之外，對未萌發(fā)孢子轉錄水平變化進行了比對（材料為對照組菌根）。

1.6 實時熒光定量PCR引物的設計及基因轉錄量的分析

根據鈣調素基因的ORF區(qū)段設計特異性引物RT258F1/RT258R1，肌球蛋白基因片段序列設計特異性引物myoF/myoR。用熒光定量PCR檢測CaM基因和myosin基因 mRNA的轉錄情況，內參基因選用Gi 18sRNA，內參引物為ALO/S112[13]。反轉錄后，取0.5 μL模板，用特異性引物RT258F1/RT258R1、myoF/myoR進行反轉錄效果的檢測；同時，利用基因的內含子區(qū)段引物201F/201spR2進行36個循環(huán)反應，對反轉錄產物進行DNA污染的驗證，無擴增條帶則為合格的cDNA樣品，用于進行實時熒光定量PCR分析。將cDNA進行5倍梯度稀釋，篩選最佳的模板加入量。

實時熒光定量PCR反應體系：上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO公司）10 μL，反轉錄產物 （cDNA第一鏈）2 μL，補蒸餾水到20 μL。利用Applied Biosystems step oneTM Real-Time PCR system Thermal cycling（ABI 7300）熒光定量PCR儀進行反應。擴增程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；之后加溶解曲線分析反應。結果分析采用2-△△ct的計算方法。

2 結果與分析

2.1 鈣調蛋白序列

結合反向PCR與3′RACE技術的結果，可從基因組DNA及cDNA上同時獲取較為完整的序列信息，將所得的序列信息使用生物軟件ClustalW程序進行序列分析，所在編碼區(qū)從起始密碼子ATG到終止密碼子TAG的cDNA長度為450 bp，ORF為762 bp，包含4個外顯子和4個內含子，而ATG前的啟動子和5′端非翻譯區(qū)的片段長度為433 bp，所得到的整個序列的G+C含量為30.87%，符合叢枝菌根真菌的基因組堿基G+C低含量的特點[14]。將叢枝菌根真菌所表達的鈣調素蛋白氨基酸序列與有代表性的其他物種所表達的鈣調素蛋白氨基酸序列進行同源比對，相似度為90.34%（圖1）。

通過已知的ORF，可按照標準的密碼子利用表獲得AMF的蛋白質序列，共149個氨基酸組成，預測其分子量大小為 17 kDa，等電點為4.18，并根據同源性比對找出其兩端的保守區(qū)域，鈣調素基因所表達的蛋白質兩端具有可與鈣離子結合的區(qū)域——EFhand超家族。

在蛋白質結構預測系統[Protein structure prediction server，（PS）2-v2）]上對鈣調素基因的編碼蛋白質進行同源建模模擬，得到其三維結構如圖2所示。所預測的蛋白質三維結構符合公認的鈣調蛋白質的三維結構特點。

2.2 實時熒光定量PCR

2.2.1 叢枝菌根真菌不同時期的生長狀況 經過統計，叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)狀態(tài)良好，真菌孢子的萌發(fā)率均為70%，而在無菌水中的真菌孢子則沒有萌發(fā)，可用于后續(xù)試驗。前期預試驗是將侵染的紫花苜蓿根段經TB染色制片后進行顯微鏡觀察，通過統計侵染率、各時間段特定結構（如附著胞、叢枝、泡囊）的數量，確定在合適時間進行后續(xù)試驗的侵染根段取樣，用于研究不同時期叢枝菌根真菌CaM的表達量變化。通過鏡檢觀察不同時期的侵染狀況（圖3）：從第5天開始進行抽樣觀察，第10天開始出現附著胞，第12天侵染點增至30%且有菌絲貫穿于根細胞內，第18天開始出現叢枝，直至第25天會有大量叢枝產生，到50 d后有泡囊形成。2.2.2 不同共生時期的盆栽試驗結果 根據叢枝菌根真菌對紫花苜蓿的侵染狀況，收獲12、18、25、50 d的根樣品提取RNA，經反轉錄后用于實時熒光定量PCR檢測。挑取消毒處理的叢枝菌根真菌孢子放入根分泌物中進行萌發(fā)生長，2周后收獲并提取RNA反轉錄成cDNA，并進行半定量的電泳檢測。結果發(fā)現，相較于休眠期孢子，萌發(fā)的叢枝菌根真菌CaM有明顯的上升表達，而肌球蛋白（Myosin）的上升表達更為明顯，可進行熒光定量分析。

叢枝菌根真菌CaM的熒光定量結果（圖4a）表明，與休眠孢子比較，該基因在共生早期，從孢子萌發(fā)開始有明顯的上調表達，這說明叢枝菌根真菌CaM蛋白質在侵染早期的功能較為顯著；12 d時表達量達到最高，但隨著侵染的深入逐漸降低。證明鈣離子和鈣調蛋白質主要是在菌根真菌與宿主植物共生早期的信號轉導上起作用。

叢枝菌根真菌肌球蛋白的熒光定量結果（圖4b）表明，在菌絲生長過程中，叢枝菌根真菌Myosin表達量增加最為明顯；在菌根真菌侵染紫花苜蓿形成共生體后該基因表達量明顯下降，但是隨著真菌菌絲在植物細胞中的延伸其表達量逐漸增高；之后由于侵染的深入、叢枝分化以及內生菌絲的生長均需要肌球蛋白來延伸AMF的細胞骨架，從而促進其生長，故呈持續(xù)遞增趨勢；50 d時，產生大量根外菌絲，叢枝菌根真菌肌球蛋白表達量增長更為明顯。肌球蛋白在菌根真菌與宿主植物的共生過程中呈梯度增長模式，這可能是因為肌球蛋白在菌絲生長過程中協助鈣調素定位在生長的活性部位。

2.2.3 共生體中叢枝菌根真菌CaM在不同脅迫處理下的轉錄變化 叢枝菌根真菌CaM在脅迫處理下的轉錄變化結果（圖5）表明，CaM對于細胞外環(huán)境刺激下的應激效應很迅速。當加入過多量的鈉鹽時，24.0 h叢枝菌根真菌CaM表達量與對照相比上升了1.75倍；在加入鎘離子后，CaM表達量在3.0 h后有上升表達，比對照高1.75倍；加入鋅離子后6.0 h，CaM表達量是對照的1.6倍；加入砷酸鹽后，與對照相比，CaM表達量有2次明顯的上升表達，分別是1.5 h和12.0 h，其中1.5 h時CaM的表達量升高較明顯。以上4種脅迫處理的結果表明，菌根共生體中菌根真菌的鈣調素在砷酸鹽、鎘離子和鈉鹽的高滲脅迫下作用較為明顯，推斷可能存在鈣離子的信號轉導過程。

3 討論

3.1 叢枝菌根真菌中鈣調素基因的功能

本研究中從AMF中克隆到CaM基因序列，與其他物種進行比對后，發(fā)現不同物種間鈣調素無論在基因序列、氨基酸序列還是功能上都是高度保守的，但是不同種屬間又有其特異性[15]。鈣調素對于細胞適應環(huán)境變化具有重要的調控作用，在一些真菌細胞中鈣調素的一些功能是保守的，但是也存在差異性，因為鈣離子信號轉導途徑會通過鈣調蛋白在不同宿主細胞內所表現的不一樣的功能來適應不同的環(huán)境[6]。病原真菌在面對環(huán)境壓力時，CaM會首先激活下游的鈣調素相關激酶（由CMK1和CMK2共同編碼）和磷酸酶（Calcineurin）[7]。

AMF中的鈣調素對于共生前期的信號轉導、早期的共生建立以及細胞適應環(huán)境變化都具有重要的調控作用。由不同時期的熒光定量分析可以看出，鈣調素的功能主要體現在共生早期階段，對于孢子萌發(fā)及共生建立有重要的指示作用，當AMF接收植物分泌的信號物質，會在真菌細胞內產生鈣離子激增現象，而鈣離子濃度的變化會被鈣調素識別，并激活下游的共生相關基因的表達。不同脅迫條件下的CaM表達量差異分析則表明細胞要適應外界的環(huán)境壓力，也需要鈣離子和鈣調素的共同參與。

鈣離子和氫離子作為轉導化學信號和環(huán)境信號的指示物質[4]，并將信號轉導給鈣調素后的分子機制仍有待研究。

3.2 叢枝菌根真菌中鈣調蛋白與肌球蛋白間的功能聯系

對絲狀真菌中鈣調素的研究證明，鈣離子對菌絲頂端生長具有促進及引導的作用，而鈣調素作為鈣離子的主要受體是這一系列變化的樞紐，從叢枝菌根真菌中分離得到的鈣調素基因與絲狀真菌的鈣調素基因在序列結構上有高度的同源性，從而推斷鈣調素在引導菌根真菌菌絲極性生長從而促進共生中有著重要的作用。本研究中叢枝菌根真菌萌發(fā)后CaM有明顯的上調表達，也可證明這一點。肌球馬達蛋白（Myosin motor）可以沿著肌動蛋白運輸細胞器，其中肌球蛋白Ⅰ型（Myosin 5α）為鈣離子依賴型，它的活性受重鏈尾部的調控。研究證明，肌球蛋白Ⅰ型在微摩爾濃度的鈣離子的刺激下，它的重鏈上的異亮氨酸-谷氨酰胺基序（IQ motif）會與CaM結合，這表明鈣離子和CaM是以此來調控肌球蛋白的功能[16]。而叢枝菌根真菌中獲得的動力蛋白typeⅠmyosin基因，在萌發(fā)過程中有非常明顯的上調表達，這很可能是因為在菌絲生長過程中肌球蛋白協助鈣調素定位在其活性部位，之后肌球蛋白基因的表達量下降，直至共生建立后菌絲在根內延生，其表達量才開始逐漸回升。

在關于輪藻（Chara）的肌球蛋白研究中也發(fā)現CaM可能是作為肌球蛋白的一條輕鏈存在，因為當鈣離子與CaM結合后，不僅可以激活肌球蛋白的能動性以及肌動蛋白依賴型ATPase的活性，還可與肌球蛋白的重鏈結合[17]。在釀酒酵母中CaM對極性生長過程也具有重要的調控作用，它會與一種肌球蛋白V型（Myo2p）相互作用行使這一功能[5]。在體外，Myo2p所包含的IQ結構位點可與CaM結合，而不需要鈣離子的參與，在細胞周期中Myo2p和CaM可能是結合共定位[18]。肌球蛋白沿著肌動蛋白運輸線粒體、分泌囊泡和液泡。在叢枝菌根真菌菌絲的萌發(fā)生長過程中，也會發(fā)現線粒體會聚集在菌絲的活性生長部位，這可能也是在肌球蛋白的參與下進行的[19]。

綜上所述，鈣離子對菌絲頂端生長中具有促進及引導作用；在菌根真菌中，鈣調素接收鈣離子的信號后引導真菌的菌絲極性生長、參與鈣離子的信號轉導從而促進共生；在抗逆性的研究中發(fā)現，鈣調素可能參與了細胞抵抗高滲環(huán)境下的鈣離子信號轉導途徑。對于今后研究菌根共生早期鈣離子信號轉導及砷脅迫下的細胞抗逆性機制有一定的指導作用。

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綜上所述，鈣離子對菌絲頂端生長中具有促進及引導作用；在菌根真菌中，鈣調素接收鈣離子的信號后引導真菌的菌絲極性生長、參與鈣離子的信號轉導從而促進共生；在抗逆性的研究中發(fā)現，鈣調素可能參與了細胞抵抗高滲環(huán)境下的鈣離子信號轉導途徑。對于今后研究菌根共生早期鈣離子信號轉導及砷脅迫下的細胞抗逆性機制有一定的指導作用。

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綜上所述，鈣離子對菌絲頂端生長中具有促進及引導作用；在菌根真菌中，鈣調素接收鈣離子的信號后引導真菌的菌絲極性生長、參與鈣離子的信號轉導從而促進共生；在抗逆性的研究中發(fā)現，鈣調素可能參與了細胞抵抗高滲環(huán)境下的鈣離子信號轉導途徑。對于今后研究菌根共生早期鈣離子信號轉導及砷脅迫下的細胞抗逆性機制有一定的指導作用。

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