高凡茸等

摘 要：傳統(tǒng)中藥中所包含的天然生物活性化合物成分十分復(fù)雜，國內(nèi)外制藥公司正在將中藥作為天然活性化合物資源庫，同時中藥的質(zhì)量穩(wěn)定性和可控性也在中藥現(xiàn)代化的進程中變得越來越重要。要開發(fā)利用這些化合物，同時建立中藥的質(zhì)量標(biāo)識，不同色譜分析方法的應(yīng)用顯得越來越重要。該文綜述了近幾年來常用的生物活性成分色譜分析和衍生化方法，為更好地了解這些成分結(jié)構(gòu)和活性提供研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：中藥；生物活性成分；色譜；衍生化

中圖分類號 R285 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）15-23-03

在中藥的開發(fā)過程中，其關(guān)鍵問題是質(zhì)量的穩(wěn)定性和可控性。一般中藥的識別是通過其形態(tài)學(xué)、TLC鑒別或者含量測定的幾個標(biāo)志物，然而這種方法由于不能提供藥品的全部性質(zhì)，所以不能區(qū)分具有相似形態(tài)或者相似化學(xué)組成的中藥。如綠原酸不能用來區(qū)分金銀花和菊花的花朵，用齊墩果酸無法識別女貞子、牛膝或威靈仙的根。中藥的多靶點和協(xié)同作用的特性來自于它們具有多種成分，因此，在天然藥物中找到一種用來反映大多數(shù)成分變化的綜合方法是有必要的，尤其是藥理作用和臨床療效的相關(guān)變化。近幾年來，中藥分析已經(jīng)開始著重于其整體性和綜合性，許多綜合方法（比如指紋圖譜—包括色譜法和光譜法、多組分分析）已經(jīng)被用于中藥質(zhì)量控制，一些基于研究藥物的吸收、分布、代謝和消除性能的生物色譜法也已經(jīng)被用于中藥分析和生物活性標(biāo)志物的篩選，并且人們引入一些其他系統(tǒng)生物學(xué)（包括基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)）來更清晰更科學(xué)地研究中藥。本文主要綜述了色譜分析及衍生化方法在中藥定性及定量分析方面的研究應(yīng)用。

1 薄層色譜法（TLC）

TLC對于中草藥分析鑒別是一個簡單、低成本、多用途的常用方法。該方法提供更多的信息和參數(shù)對中藥進行全面識別和評價。與常規(guī)TLC有顯著不同的微乳液薄層色譜（ME-TLC），其可以提供更高的檢測靈敏度和更好的分辨率及重現(xiàn)性[1]。

2 GC及其聯(lián)3用技術(shù)

由于GC和GC-MS的靈敏度、穩(wěn)定性和高效率，該方法通常用于中藥中揮發(fā)油成分的分析。全二維氣相色譜（GC×GC）[2-3]是一種新穎的技術(shù)，該技術(shù)迅速對復(fù)雜混合物的分析具有明顯優(yōu)勢，被認(rèn)為是氣相色譜法中最強大和最靈活的分離工具。這項技術(shù)是通過一個調(diào)制器將2根色譜柱與不同的分離機制結(jié)合在一起，因此它具有更高的靈敏度，更好的分辨率和容量，便于未知的化合物鑒定的組分離。利用該技術(shù)，在羌活中一共有769個化合物被初步鑒定和量化，對不同產(chǎn)地的這種植物分化提供了有用的信息。該方法常被人們用來發(fā)現(xiàn)一些微量化合物或者污染物，建立全面的指紋圖譜和探索中藥或其他藥物中未知的揮發(fā)性化合物等。

3 HPLC及其聯(lián)用技術(shù)

在中藥眾多的分析方法中，HPLC仍然是最流行的方法，這是由于它易操作、適用性廣，同時對中藥定性和定量準(zhǔn)確度高。有學(xué)者研制出了一個HPLCESI/TOF-MS 方法，該方法能夠同時地分析和量化山茶花中32種活性化合物，具有高選擇性、高靈敏度和高精確度的特點[4]。然而，很難獲得這么多對照品，所以大多數(shù)這樣多組分定量方法仍被保留在實驗室研究中。此外，在不同的儀器、不同的實驗室相對校正因子的潛在波動應(yīng)進一步驗證。

HPLC的一個主要優(yōu)點是可以和許多檢測器聯(lián)用，比如UV、DAD、ELSD、FLD、RID、MS和NMR等，HPLC可以提供更多的可能性用來探測不同的組成類型[5-11]。最近幾年，人們已經(jīng)將電量檢測電極陣列（HPLC-CEAD）和電霧式檢測器（CAD）引入中藥分析[12-13]。CAD[7]是一個定量檢測器，該檢測器是進行三七皂苷分析時第一次將其運于中藥分析，它和ELSD有著相似的性能，比如適合于UV無吸收或吸收弱的化合物，但是CAD有著更高的靈敏度，更寬的測試范圍和更好的重現(xiàn)性。除了HPLC獲得更合理的檢測器，毛細(xì)管高效液相色譜和超高效液相色譜（UPLC）的出現(xiàn)提高了分析效能，所以取得了分析時間更短、分離效果更好的結(jié)果[14]。到目前為止，已經(jīng)報道將UPLC運于中藥分析的例子越來越多[15]。HPLC研究的另一個有前途的發(fā)展是引入全二維LC法（2D HPLC），該法比一維LC法更高的能力、分辨率和分離效率[16]。Ma結(jié)合排阻色譜和反相液相色譜柱去分析復(fù)雜的藥方，清開靈注射液。和傳統(tǒng)的一維色譜法相比，2D LC具有較高的峰值容量和自動化程度高[17]。

在實際應(yīng)用中，人們發(fā)現(xiàn)有些因素影響二維色譜的發(fā)展，比如：（1）在二維色譜中非正交和小峰容量；（2）不親和性，包括二維中流動相的不混溶性和流動相與MS檢測器之間的不親和性；（3）2個維度不匹配的分離速度，尤其是慢的速度在第二維中。因此，為了解決這些問題，人們已經(jīng)做了一些改進。比如，新接口的開發(fā)是為了克服溶劑不混溶性，并減少了進樣體積到第二維；一些新的固定相，比如乙二醇固定相和β-環(huán)糊精固定相，或者新的組合反相和親水作用色譜法（RPLC/HILIC）、排阻色譜和反相色譜法（SEC/RPLC），離子交換和排阻色譜法（IEC/SEC）]被引入到2DLC系統(tǒng)，除了常用的NPLC和RPLC的組合[18]。

HPLC檢測及其聯(lián)用技術(shù)等在應(yīng)用上的大力發(fā)展，為中藥中活性成分的研究打下了堅實的基礎(chǔ)，然而，許多活性成分，如氨基酸類、糖類等，因為本身不具有光學(xué)活性或活性很低，難以在常規(guī)條件下檢測得到，衍生化方法則可以很好地解決這一問題。衍生化方法的作用主要是通過衍生化試劑為活性成分帶上一個具有光學(xué)活性的基團，使活性成分的信號增強，提高上述樣品檢測的靈敏度。同時，經(jīng)過衍生化之后的活性成分可能發(fā)生結(jié)構(gòu)上的改變，所以衍生化方法還可以降低活性成分的分離難度，為活性成分的回收純化奠定基礎(chǔ)。

常用衍生化試劑一般分為紫外和熒光2類，同時一般具有熒光基團的物質(zhì)都能吸收紫外光，因此，熒光衍生化試劑適用于紫外和熒光檢測器同時檢測。常用的衍生化方法包括柱前衍生化方法和柱后衍生化方法2類。因為柱前衍生化方法對衍生化反應(yīng)的動力學(xué)因素、反應(yīng)試劑、條件和時間等限制較少，而且所得衍生化產(chǎn)物可以在衍生化之后進一步進行純化，而不要求附加的儀器設(shè)備，所以柱前衍生化方法的應(yīng)用更為廣泛。endprint

早期的衍生化試劑大多是采用還原胺化的原理，所以衍生化試劑多含有氨基結(jié)構(gòu)。氨基吡啶（2-AP）是早期研究中常用的衍生化試劑，且仍在現(xiàn)代研究中被廣泛采用。氨基吡啶衍生化反應(yīng)的原理在于，通過2-AP的氨基，還原胺化后為糖類成分的還原端帶上熒光基團，得到的衍生化產(chǎn)物可以同時被紫外檢測器和熒光檢測器進行檢測。然而，2-AP衍生化也存在一些不足之處，如過量的衍生化試劑、衍生化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的一些副反應(yīng)產(chǎn)物等，都可能干擾衍生化產(chǎn)物的檢測，必須提前除盡。氨基苯甲酸醉類衍生化試劑如氨基苯甲酸（2-AA）是一種低特異性、高靈敏性的衍生化試劑，能與各類不同的糖類成分反應(yīng)，得到具有紫外基團的衍生產(chǎn)物。而在一般的HPLC分離檢測中，2-氨基苯甲酞胺（2-AB）越來越受到廣泛的利用，這是因為2-AB進行還原胺化反應(yīng)后，可以忽略檢測過程中的背景信號，且適用于糖苷、寡糖和糖蛋白等多種含糖成分。

基于還原胺化反應(yīng)的衍生化反應(yīng)具有上述特點，但是因為反應(yīng)過程需要加酸催化，而且反應(yīng)過程耗時長，且進度難控制，所以被1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）逐步取代。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化反應(yīng)無需酸催化作用，產(chǎn)生的衍生化產(chǎn)物不存在立體異構(gòu)體的問題，而且因為產(chǎn)物帶電，所以可以選擇多種分離模式，滿足不同的分析要求。當(dāng)前在研究者的不斷嘗試和改進下，PMP衍生化不僅可以完成中性糖、酸性糖和堿性糖成分的分離，還可以用于單糖、寡糖以及氨基酸的分離檢測。

此外，還有一些衍生化試劑，如2-氨基乙硫醇（2-aminoethanethiol，AET），2-氨基苯硫醇（2-aminobenzenethiol，ABT），l，2-二氨基-4，5-亞甲基二苯酚，8-氨基萘-l，3，6-三磺酸二鈉鹽（8-amino-naphthalene-l，3，6-trisulfonic acid，ANTS）等，則適用于電泳分離、質(zhì)譜直接檢測等。

4 毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳（CE）的主要缺點是靈敏度低，原因是進樣體積小和在最常用的UV檢測器中光程短。為了提高檢測靈敏度，人們提出2個主要的方法：一個是運用更高靈敏度的檢測器（比如激光誘導(dǎo)熒光（LIF）、電化學(xué)、MS、熒光和化學(xué)發(fā)光檢測器），另一個是檢測樣品的預(yù)濃縮[19]。在過去5a，人們已經(jīng)開發(fā)了幾種在線樣品預(yù)濃縮的方法。在某種情況下，在樣品預(yù)濃縮之后，靈敏度提高多于100倍.

在中藥運用CE分析的過程中，為了獲得更好的分離結(jié)果，應(yīng)該使色譜條件（包括緩沖液濃度、pH、添加劑和電壓）達到最佳。一些方法（包括單因素設(shè)計、正交設(shè)計、均勻設(shè)計、中心合成設(shè)計和遺傳算法）已經(jīng)被人們使用。除了這些，Jiao等運用連續(xù)小波變換（CWT）解決CE中重疊峰和定量確定共洗脫化合物[20]。

5 結(jié)語

在目前的分析方法中，色譜法仍然是主流。中藥的使用，在我們國家有著悠久的歷史，如果通過對中藥中生物活性成分色譜分析方法的研究，發(fā)現(xiàn)有效的生物活性成分，并將其引入戒毒領(lǐng)域研究，這將為我國在禁毒領(lǐng)域的戒毒藥物的研究提供了強有力地技術(shù)保證。

參考文獻

[1]Lee CJ，Huo YS，Lee LH，et al.Immunomodulating fungal and plant polysaccharides：Biochemistry，immunologic activity and clinical application[J].J Trad Med，2004，21：67-80.

[2]Wasser SP.Medicinal mushroom science：history，current status，future trends，and unsolved problems[J].Int J Med Mushr，2010，12：11-16.

[3]Chang R.Bioactive polysaccharides from traditional Chinese medicine herbs as anticancer adjuvants[J].J Altern Complement Med，2002，8：559-565.

[4]Xiao-Yan Gaoa，Yong Jianga，Jian-qiu Lub，Peng-Fei Tua.One single standard substance for the determination of multiple anthraquinone derivatives in rhubarb using high-performance liquid chromatography-diode array detection[J].Chromatogr.A，2009，1216（11）：2118-2123.

[5]Moradali MF，Mostafavi H，Ghods S，Hedjaroude GA.Immunomodulating and anticancer agents in the realm of macromycetes fungi （macrofungi） [J].Int Immunopharmacol，2007，7：701-724.

[6]Caffall KH，Mohnen D.The structure，function，and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides[J].Carbohydr Res，2009，344：1879-1900.

[7]Ermerk IM，Barabanova AO，Kukarskikh TA，et al.Natural polysaccharide carrageenan inhibits toxic effect of Gram-negative bacterial endotoxins[J].Bull Exp Biol Med，2006，141：230-232.endprint

[8]Lau KM，He ZD，Dong H，et al.Anti-oxidative，anti-inflammatory and hepato-protective effects of Ligustrum robustum[J].J Ethnopharmacol，2002，83：63-71.

[9]Paulsen BS.Biologically active polysaccharides as possible lead compounds[J].Phytochem Rev，2002，1：379-387.

[10]Paulsen BS，Barsett H.Bioactive pectic polysaccharides[J].Adv Polym Sci，2005，186：69-101.

[11]Yamada H，Kiyohara H.Immunomodulating activity of plant polysaccharide structures[J].Comprehensive Glycosci，2007，4：663-694.

[12]Moradali MF，Mostafavi H，Ghods S，Hedjaroude GA. Immunomodulating and anticancer agents in the realm of macromycetes fungi （macrofungi） [J].Int Immunopharmacol，2007，7：701-724.

[13]Kidd PH. The use of mushroom glucans and proteoglycans in cancer treatment[J]. Alt Med Rev，2000，5：24-27.

[14]Zekovic DB，Kwiatkowski S，Vrvic MM，et al.Natural modified （1，3）-beta-glucans in health promotion and disease alleviation[J]. Crit Rev Biotechnol，2005，25：205-230.

[15]Xintian Zheng，Peiying Shi，Yiyu Cheng，Haibin Qu.Rapid analysis of a Chinese herbal prescription by liquid chromatography–time-of-flight tandem mass spectrometry[J].Chromatogr.A，2008，1206 （2）：140-146.

[16]Yanming Liu，Xingya Xue，Zhimou Guo，et al.Novel two-dimensional reversed-phase liquid chromatography/hydrophilic interaction chromatography，an excellent orthogonal system for practical analysis[J].Chromatogr.A，2008，1208（1-2）：133-140.

[17]Hongzhe Tian1，Jing Xu，Yafeng Guan.Comprehensive two-dimensional liquid chromatography （NPLC×RPLC） with vacuum-evaporation interface[J].Sep.Sci，2008，31（10）：1677-1685.

[18]Nair PK，Rodriguez S，Ramachandran R，et al.Immune stimulating properties of a novel polysaccharide from the medicinal plant Tinospora cordifolia[J].Int Immunopharmacol，2004，4：1645-1659.

[19]Inoue A，Kodama N，Nanba H.Effect of Maitake （Grifola frondosa） D-fraction on the control of the T lymph node Th-1/Th-2 proportion[J].Biol Pharm Bull，2002，25：536-540.

[20]Long Jiaoa，Suya Gaoa，F(xiàn)ang Zhangb，et al.Quantification of components in overlapping peaks from capillary electrophoresis by using continues wavelet transform method[J].Talanta，2008，75（4）：1061-1067.

（責(zé)編：張宏民）endprint