張大雷，張吉林，才志成

(黑龍江省公安廳刑事技術(shù)總隊，哈爾濱150008)

八珍湯源自古方《正體類要》，是四君子湯和四物湯的合方，由人參、熟地、川芎、白芍、當(dāng)歸、茯苓、白術(shù)、甘草8味中藥組成，經(jīng)古今廣泛臨床實踐證明可同時具備補氣補血雙重功效的經(jīng)典方劑[1－3].其中芍藥苷是八珍湯的重要活性成分之一，具有有降低血液黏度、抗血小板聚集、改善微循環(huán)、擴張血管、神經(jīng)保護(hù)、降血糖、抗氧化、抗驚厥等作用[4－6].因此，本文選擇芍藥苷作為目標(biāo)成分對八珍湯復(fù)方進(jìn)行質(zhì)量濃度測定.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀(W2695Separations Module、W2996Photodiode Array Detector、自動進(jìn)樣器，Empower化學(xué)工作站);751型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司);R－201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);恒溫水浴鍋;真空干燥箱(上海一恒儀器有限公司);電子天平(美國奧好斯科技有限公司);DPS統(tǒng)計軟件(北京中農(nóng)博思科技發(fā)展有限公司).

芍藥苷(中國藥品生物制品檢定所，批號為:110736－200320);乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純;水為二次蒸餾水.所有藥材人參(Panax ginseng C.A.Mey.)、熟地黃(Radix Rehmanniae praeparata)、白芍(Paeonia lactiflora Pall.)、當(dāng)歸(Angelica sinensis(Oliv.)Diels)、白術(shù) (Atractylodes macrocephala Koidz.)、茯 苓 (Poriacocos(Schw.)Wolf)、川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)、甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)均經(jīng)鑒定符合中國藥典2005版規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求.

1.2 色譜條件

色譜柱:Symmetry C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:乙腈 －0.05%磷酸水溶液(15∶85);檢測波長:230 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μL.

圖1 (A) 芍藥苷空白樣品色譜圖(B)樣品中芍藥苷色譜圖(C)芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

1.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀測試，芍藥苷的保留時間為tR=8.273 min，理論塔板數(shù)以芍藥苷計不低于5 000，芍藥苷色譜峰與相鄰未知色譜峰的分離度大于1.5.

1.4 空白實驗

按處方比例，制成不含芍藥的陰性樣品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果在芍藥苷保留時間8.273 min處沒有峰，說明其他成分對芍藥苷的測定無干擾.見圖1(A)、(B)、(C).

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇定容，配成質(zhì)量濃度分別為0.014、0.028、0.056、0.112、0.224 mg/mL的對照品溶液，分別取20 μL注入高效液相色譜儀中，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，以芍藥苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算線性回歸方程.測得芍藥苷的線性回歸方程為 Y=40798281 X+2855，r=0.9998(n=5)，結(jié)果表明:芍藥苷在0.014～0.224 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系.結(jié)果見表1.

表1 高效液相測定芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積值結(jié)果(n=5)

1.6 精密度實驗

分別精密吸取芍藥苷(0.028 mg/mL)對照品溶液，連續(xù)5次進(jìn)樣，測定芍藥苷的峰面積，測得芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.37%(n=5)，表明該方法精密度良好.結(jié)果見表2.

表2 芍藥苷精密度實驗結(jié)果(n=5)

1.7 穩(wěn)定性實驗

分別精密吸取樣品溶液，在 0、3、6、12、24 h 分別進(jìn)樣分析測定，測定芍藥苷的峰面積，并計算RSD值，考察所測成分芍藥苷在0～24 h內(nèi)的穩(wěn)定性.測定芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.34%(n=5)，結(jié)果顯示其在0～24 h內(nèi)穩(wěn)定.結(jié)果見表3.

表3 樣品中芍藥苷穩(wěn)定性實驗結(jié)果(n=5)

1.8 重復(fù)性實驗

分別平行制備5份樣品溶液進(jìn)樣，測定樣品中芍藥苷的質(zhì)量濃度，并計算RSD值，考察方法的重復(fù)性.測得樣品中芍藥苷的質(zhì)量濃度分別為2.2260 mg/g，RSD 值為1.65%(n=5)，結(jié)果表明本方法的重復(fù)性較好.結(jié)果見表4.

表4 樣品中芍藥苷重復(fù)性實驗結(jié)果(n=5)

1.9 回收率實驗

取已測得芍藥苷質(zhì)量濃度的樣品溶液各9份，分別加入相當(dāng)于樣品80%、100%、120%的芍藥苷對照品溶液，測定芍藥苷的質(zhì)量濃度，計算加樣回收率，并計算RSD值.測得芍藥苷的回收率為98.85%，RSD 為0.08%(n=3).結(jié)果見表5.

表5 芍藥苷加樣回收率(n=3)

2 樣品測定

精密稱取八珍湯濃縮浸膏適量，用甲醇溶解，定容于5 mL的容量瓶中，搖勻，并用微孔濾膜(0.45 μm)過濾后進(jìn)樣，測定峰面積，計算樣品中芍藥苷的質(zhì)量濃度.結(jié)果見表6，色譜圖見圖1.

表6 樣品中芍藥苷質(zhì)量比測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)語

本實驗建立了八珍湯復(fù)方中芍藥苷的HPLC測定方法，線性范圍寬、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好、專屬性強、操作簡便、無干擾，對八珍湯的質(zhì)量控制具有重要的意義.本方法同樣適用于八珍湯苷類部位中芍藥苷的質(zhì)量比測定，對苷類部位純化工藝研究和進(jìn)一步開發(fā)提供了理論依據(jù).

[1]郭曉娜，封銀曼.八珍湯臨床及實驗研究進(jìn)展[J].光明中醫(yī)，2007，22(4):62－63.

[2]張 超，南莉莉，孫 志，等.八珍湯物質(zhì)基礎(chǔ)及其藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].上海醫(yī)藥，2008，29(6):273－276.

[3]潘洪平.八珍湯的藥理研究和臨床應(yīng)用[J].中成藥，2003，25(11):附2－附4.

[4]高小榮，田庚元.白芍化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志，2006，15(6):416－418.

[5]鄭世存，李曉宇，歐陽兵，等.芍藥苷藥理作用研究新進(jìn)展[J].中國藥物警戒，2012，9(2):100－103.

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