蔡文嬌+徐大彬+藍霞+謝紅輝+韋繼光

摘 要：真菌基因組高通量測序?qū)NA純度和含量要求較高，通過月桂酸鈉法、CTAB法和酶裂解法分別提取真菌基因組DNA，然后進行瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 1000測定DNA濃度和純度，結果證明月桂酸鈉法提取的真菌基因組總DNA更適合應用于真菌基因組高通量測序。

關鍵詞：月桂酸鈉法 真菌 基因組DNA

真菌為低等真核生物，種類龐大而多樣 [1]，在最近的幾年里，隨著測序技術的不斷提高和大片段測序價錢的降低，大量真菌被測序，真菌基因組學研究快速發(fā)展。特別是真菌比較基因組學的分析已成為生物進化、系統(tǒng)發(fā)生學、藥物靶基因、基因發(fā)現(xiàn)以及基因功能等方面的研究 [2-3]。而真菌基因組DNA的濃度和純度直接關系到真菌基因組的測序和組裝，從而進一步影響后續(xù)的基因注釋及分析。高質(zhì)量和大片段（>30 kb）的真菌基因組DNA可以用于10 kb文庫構建和高通量測序。有些真菌由于色素、多糖含量較高，使得傳統(tǒng)CTAB方法提取不能獲得高純度、大量的基因組DNA，給后續(xù)測序工作帶來很大難度。例如，產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum） [4]，該菌產(chǎn)生色素很多，用傳統(tǒng)方法很難完全去除色素；對于一些含糖量多的真菌，如冬蟲夏草菌（Ophiocordyceps sinensis）中至少含有20種多糖，約占蟲草總干質(zhì)量的3 %～ 8 % [5]，這一類真菌傳統(tǒng)方法提取的基因組DNA是達不到高通量測序的要求的。試驗采用月桂酸鈉法、CTAB法和酶解法分別提取了相同的4株真菌基因組總DNA。這4株真菌都屬于Ophiocordyceps sinensis菌株，多糖和色素含量較多。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

Ophiocordyceps sinensis菌株4株，由中國科學院微生物研究所真菌學國家重點實驗室劉杏忠研究員課題組提供。真菌在鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25 ℃，7～20 d。

1.1.2 儀器

恒溫電熱水槽，電子分析天平，低溫離心機，移液器，NanoDrop 1000，電泳槽，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)

1.1.3 主要試劑

液氮、1 %月桂酸鈉、100 mM NaCl、Tris飽和酚、氯仿-異戊醇（24+1）、異丙醇、70 %乙醇（v/v）、無菌ddH2O、RNase A（Sigma，100 mg/mL）、RNase T1（Fermentas，1000 U/μl，用TE稀釋至1000 U/mL）。

1.1.4 溶液配制

1 %月桂酸鈉裂解液：100 mM Tris-HCl（pH 8.0），20 mM EDTA，1 % 月桂酸鈉，100 mM NaCl，121 ℃滅菌30 min。

TE（pH 8.0）：10 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 mM EDTA，1×105 Pa滅菌30 min。

CTAB 裂解液：100 mM Tris-HCl（pH 8.0）、20 mM EDTA（pH 8.0）、1.4 mol / L NaCl。

3M 乙酸鈉（pH 5.5）：稱取24.61 g乙酸鈉，加80 mL ddH2O溶解，用乙酸調(diào)節(jié)pH至5.5，加ddH2O定容至100 mL，0.22 μm濾膜過濾除菌。

裂解緩沖液：50 mM Tris·HCl（pH 8.0），50 mM EDTA，1 % SDS，10 mM NaCl，1×105 Pa滅菌30 min。

蛋白酶 K（Sigma，10 mg/mL，用無菌ddH2O溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌）。

1.2 真菌基因組總DNA提取方法

1.2.1 月桂酸鈉法提取真菌基因組總DNA

用無菌藥匙從PDA培養(yǎng)皿中刮取菌絲至無菌研缽中，加液氮用無菌研棒充分研磨至粉末狀。在研缽中不斷加入液氮，使菌絲在液氮中得到保護，避免基因組DNA降解。研磨時不斷連續(xù)研缽，當液氮快要揮發(fā)完時再次加入，切勿使液氮完全揮發(fā)后再加入。提前稱量無菌50 mL離心管重，小心將粉末分裝至無菌50 mL離心管中（每管不超過2.5 g菌絲粉末），室溫放置1～2 min，再稱量50 mL離心管重，計算樣品粉末重量。將真菌粉末加入預冷離心管，加入1 %月桂酸鈉裂解液（按照1 g粉末加入7 mL 月桂酸鈉裂解液的比例），用手不斷晃動離心管顛倒混勻，15～20 min后，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液（25+24+1），充分顛倒混勻，12000 rpm離心10 min。吸取上清液至一新無菌50 mL離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇（24+1），輕柔顛倒混勻，12000 rpm離心10 min。吸取上清液至一新無菌50 mL離心管中，加入等體積異丙醇（4 ℃預冷），1/10體積乙酸鈉。室溫下靜止5 min。輕微搖晃離心管，可在離心管內(nèi)用肉眼觀察到絮狀的DNA沉淀。將離心管朝一個方向水平轉(zhuǎn)動，使絮狀DNA沉淀彼此纏繞，最終形成條狀。將DNA條狀物輕微吸出至干凈的15 mL離心管中。加入9 mL 70 %乙醇（4 ℃預冷）洗滌1次，12000 rpm離心5 min。色素多的菌可用70 %乙醇洗滌多次后再離心。小心倒去上清液。將剩余液體盡量吸凈并于超凈工作臺內(nèi)風干。加入適量（500 μL至1 mL）TE（pH 8.0）或無菌的ddH2O溶解DNA，37 ℃放置1h以充分溶解。通常情況下，RNA并未除盡，可按樣品體積加入1/100體積的濃度為10 mg/mL的RNase A（終濃度為100 μg/mL）并在37 ℃處理30 min，除去RNA。防止DNA鏈斷裂，操作要輕柔，不要劇烈晃動，要用剪槍頭，添加試劑時要沿管壁緩慢加入，DNA不要反復凍融。

1.2.2 CTAB法提取真菌基因組總DNA

參照Saghai [6]和Guo [7]等的方法，把刮取和稱量好的菌絲用液氮在研缽中磨成粉末，中加入65 ℃預熱1h；10000 r /min離心10 min。取上清，將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25+24+1），輕輕顛倒數(shù)次，然后12000 r /min離心10 min；重復抽提1次；然后轉(zhuǎn)移上清到新的1.5 mL離心管中，加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3 M乙酸鈉溶液，輕輕混勻，于-20 ℃放置30 min后12000 rpm離心10 min；除去上清，沉淀可用70 %乙醇洗滌多次后再離心。小心倒去上清，將剩余液體盡量吸凈并于超凈工作臺內(nèi)風干。加入適量（500 μL至1 mL）TE（pH 8.0）或無菌的ddH2O溶解DNA，37 ℃放置1 h以充分溶解。獲得的DNA，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶解法提取真菌基因組DNA

提取高通量真菌基因組DNA時對真菌菌絲的前處理不一樣，把刮取和稱量好的菌絲中加入37 ℃預熱的裂解緩沖液（按照1 g粉末加入5 mL lysis buffer的比例），充分混勻，按體積加入1/1000體積的濃度為100 mg/mL的RNase A（終濃度為100 μg/mL）和1/100體積的濃度為1000 U/mL的RNase T1（終濃度為10 U/mL），37 ℃水浴1 h，期間每隔15 min輕柔混勻1次。1 h后，按體積加入1/100體積的濃度為10 mg/mL的蛋白酶K（終濃度為100 μg/mL），55 ℃水浴18～21 h。按體積加入1/10體積的3M 乙酸鈉（pH 5.5）和1倍體積的Tris 飽和酚（55 ℃預熱），輕柔顛倒混勻10 min。離心操作與CTAB法一致。

1.3 提取獲得DNA質(zhì)量檢測

1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測

真菌基因組DNA提取原液5 μL于1.2 %瓊脂糖凝膠電泳，100 V，30 min檢測DNA大小，然后用凝膠成像分析系統(tǒng)（Gellabsystem）拍照。

1.3.2 濃度和純度檢測

取1 μL樣品用Nanodrop1000檢測濃度和純度，一般認為2.0

2 結果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組總DNA

從電泳結果（圖1）可以看出，3種方法提取的基因組總DNA片段大小一致，說明3種方法都可以用于提取基因組DNA。CTAB法提取的基因組DNA條帶拖尾彌散，可能是提取過程中DNA發(fā)生降解，且部分條帶只適合建小片段的庫，不能構建大于2 K的庫；酶解法提取的基因組DNA條帶弱，有些DNA已經(jīng)降解；月桂酸鈉法提取的基因組DNA條帶亮、清晰，沒有雜蛋白和RNA的污染，說明該法提取真菌基因組DNA效率更高。

2.2 各提取方法獲得真菌基因組總DNA的濃度和純度比較

用Nanodrop1000檢測3種方法提取的基因組DNA的濃度和純度（表1），其中月桂酸鈉法提取的真菌基因組DNA得率最高，可達149.0 mg/mL，酶解法次之；月桂酸鈉法提取的真菌基因組DNA OD260/OD280比值都接近1.8，說明它們的純度都較高，蛋白抽提效果都較好。

2.3 不同DNA提取方法耗時比較

針對真菌基因組總DNA的3種提取方法效率比較結果見表2?？梢娫鹿鹚徕c法具有耗時短的優(yōu)勢，尤其在樣品高通量時，優(yōu)勢更突出。

3 討論

CTAB法來源于植物DNA的提取 [8]，后逐漸應運于真菌菌絲體為材料的 DNA 提取，但由于真菌多糖、多酚等次生物質(zhì)的存在使提取的真菌 DNA 中總殘留多糖雜質(zhì)，且CTAB是一種陽離子表面活性劑，由于其許多理化性質(zhì)與核酸很相似，因此很難將它們分開，同時，易于存在多糖的污染，使 DNA 定量不準 [9]。月桂酸鈉是一種陰離子表面活性劑，生物降解性很好，不僅有澄清去污作用，還可以促進沉降，月桂酸鈉可以很好地洗脫真菌中存在的多糖、色素和多酚等次生物質(zhì)，使沉降的DNA純度更高。

與傳統(tǒng)方法比較，第一，月桂酸鈉法不需要超低溫離心，只需要普通離心機和水浴，在一般的微生物實驗室就切實可行；第二，月桂酸鈉法提取步驟少，提取時間短，提取的過程簡單，最大程度地減小了提取過程中DNA的降解，DNA得率高，較為完整，能夠獲得更加大量而純度高的DNA樣品；第三，月桂酸鈉法可以有效將色素、多糖等雜質(zhì)去除，使得提取的DNA更純。

同時酶解法提取總DNA需加裂解緩沖液及蛋白酶K過夜，而月桂酸鈉法不用，且后者提出的總DNA總量遠遠多于CTAB法。綜合而言，月桂酸鈉法是一種提取真菌基因組總DNA 較穩(wěn)定和高效的方法。

試驗首次采用月桂酸鈉法，提取到了純度和濃度都很高的DNA。與傳統(tǒng)CTAB法及酶解法真菌基因組DNA提取方法相比，結果顯示，月桂酸鈉法提取真菌基因組DNA具有明顯優(yōu)勢，能夠獲得高純度及高濃度的真菌基因組DNA，本方法將為真菌基因組測序前期制備大片段文庫提供高質(zhì)量的基因組DNA。這種新的提取真菌基因組DNA的方法還同樣適用于細菌和植物基因組DNA的提取。

參考文獻

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